Hagyományos citogenetika a kariotípus tanulmányozása során mindig a sávfelbontási szintre korlátozódott. Még a differenciális kromoszómafestés nagy felbontású módszereinek alkalmazásakor is csak több sávot észleltünk egy kromoszómán, de nem voltunk biztosak abban, hogy a felbontás molekuláris szintjére jutottunk. Legújabb eredmények DNS-technológiák és citogenetika tettek lehetséges felhasználása FISH módszerek a kromoszómális DNS változásainak molekuláris szintű elemzésére. A molekuláris citogenetika forradalmi áttörést hozott a citogenetikában, lehetővé téve:

A kromoszómák DNS-szerkezetének elemzése 10-100 kilobázis tartományban;
nem osztódó interfázisú sejtek diagnosztizálása, ami óriási hatással volt a prenatális diagnózisra és a preimplantációra genetikai diagnosztika(PGD).

FISH technológia DNS-próbát használ, amely megköti vagy összekapcsolja a kromoszómán belüli specifikus DNS-szekvenciákat. A denaturált próbát a sejt natív DNS-ével inkubálják, amely szintén egyszálú állapotba denaturálódik. A szonda a biotin-dezoxiuridin-trifoszfátot vagy a digoxigenin-uridin-trifoszfátot timidinre cseréli. A natív DNS próbával történő renaturálása után a próba-DNS komplex fluorokrómmal jelölt biotinkötő avidin vagy fluorokrómmal jelölt anti-digoxigenin hozzáadásával detektálható. További jelerősítés érhető el antiavidin hozzáadásával és a kapott komplex fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatával. Különböző DNS-próbák több különböző fluorokrómmal való megjelölésével lehetőség nyílik egy sejten belüli több kromoszóma vagy kromoszómaszegmens egyidejű megjelenítésére többszínű jelként.

Meghatározási lehetőség specifikus génszegmensek A kromoszómákon jelenlévő vagy hiányzó génszekvencia-szindrómák DNS-szintű diagnosztizálását, valamint az interfázisú magokban, gyakran az egyes sejtekben bekövetkező transzlokációkat tette lehetővé.

Anyag a HAL vagy az osztódó sejtekből nyert metafázisú kromoszómák, vagy az osztódás stádiumában nem lévő sejtekből származó interfázisos magok szolgálhatnak. A metszeteket RNázzal és proteinázzal előkezelik, hogy eltávolítsák az RNS-t, amely kereszthibridizálódhat a próbával és a kromatinnal. Ezután formamidban hevítik a DNS denaturálására, és jéghideg alkohollal rögzítik. A próbát ezután melegítéssel hibridizációra készítik elő. A próbát és a kromoszómapreparátumot ezután összekeverjük, és 37 °C-on fedőlemezzel lezárjuk a hibridizációhoz. Az inkubációs hőmérséklet vagy a hibridizációs oldat sóösszetételének változtatásával a kötődési specifitás növelhető és a háttérjelölés csökkenthető.

Fluoreszcencia in situ hibridizáció alkalmazása - FISH technológia

A FISH technológia hatékonysága először a gének lokalizálásával mutatták ki. A fluoreszcens jelölés bevezetésével az in situ hibridizáció nélkülözhetetlennek bizonyult a nem kimutatható kromoszóma-rendellenességek diagnosztizálásában hagyományos módszerek sávozás. FISH is játszott kulcsszerep az egyik legszokatlanabb felfedezésben modern genetika- genomikus lenyomat.

Fejlesztési technológiája HAL három formában érkezett. A Centromer vagy alfa-szatellit próbákat relatív kromoszómaspecifitás jellemzi, és leggyakrabban az interfázisú sejtek genetikájában alkalmazták. Ezek a próbák kissé diffúz, megfelelő erősségű jeleket generálnak a centromer régióban, de nem kereszthibridizálódnak hasonló centromer szekvenciájú kromoszómákkal. Jelenleg olyan egykópiás szondákat fejlesztettek ki, amelyek egy adott kromoszómasávból diszkrét jelet adnak, és elkerülik a kereszthibridizáció jelenségét. Ezek a próbák arra is használhatók, hogy meghatározzák a kópiaszámot és azon kromoszómarégiókat, amelyekről feltételezhető, hogy egy adott szindrómához kapcsolódnak. A 13-as, 18-as, 21-es, X és Y kromoszómára tervezett egykópiás és centromer szondákat használják a prenatális diagnózishoz.

Lehetőség van a teljes kromoszómák „festésére” is HAL. A spektrális kariotipizálási technológiának köszönhetően, amely különböző fluorokrómok keverékét használja, ma már minden egyes kromoszómához egyedi fluoreszcens mintázat hozható létre 24 különálló színnel. Ez a technológia lehetővé teszi olyan összetett kromoszóma-átrendeződések kimutatását, amelyek a hagyományos citogenetikai technikák segítségével nem láthatók.

Módszer HAL a prenatális diagnosztikában. Az előrehaladott reproduktív korú nők számára a terhesség nem annyira örömre, mint inkább aggodalomra adhat okot. A nő életkora a magzati kromoszóma-rendellenességek kialakulásának kockázatával jár. Az amniocentézis a terhesség 16. hetében történik, majd a kariotípus elemzés 10-14 napig tart. A FISH előzetes vizsgálatban történő alkalmazása felgyorsíthatja a diagnózist és csökkentheti a várakozási időt. A legtöbb genetikus és laboratórium azon a véleményen van, hogy a FISH-t nem szabad elszigetelten használni a terhesség további kezelésével kapcsolatos döntések meghozatalához. A FISH-módszert ki kell egészíteni kariotípus-analízissel, melynek eredményeinek legalább korrelálniuk kell a patológiás képpel. ultrahang vizsgálat(ultrahang) vagy biokémiai szűrés anyai vér felhasználásával.

Gén szindrómák sorozatok más néven mikrodeléciós szindrómák vagy szegmentális aneuszómia. Ezek a szomszédos kromoszómafragmensek deléciói, amelyek általában sok gént érintenek. A génszekvencia-szindrómákat először 1986-ban írták le klasszikus citogenetikai technikákkal. Mostantól a FISH-nak köszönhetően lehetőség nyílik a szubmikroszkópos deléciók DNS-szintű azonosítására, ami lehetővé tette egy adott szindróma kialakulásához kapcsolódó legkisebb deletált régió, az úgynevezett kritikus régió azonosítását. A szindróma kritikus régiójának azonosítása után gyakran lehet azonosítani azokat a specifikus géneket, amelyek hiánya a szindrómához kapcsolódik. Egy nemrégiben megjelent génszekvencia-szindrómák kézikönyve 18 deléciós és mikrodeléciós szindrómáról számol be, amelyek 14 kromoszómához kapcsolódnak. A leggyakoribb génszekvencia-szindrómák és azok klinikai megnyilvánulásai táblázatban vannak megadva. 5-2.

Telomerek- a kromoszómák hosszú és rövid karjainak végeit borító képződmények. Ismétlődő TTAGGG szekvenciákból állnak, és megakadályozzák a kromoszómák végeinek fúzióját egymással. A telomer próbák fontos szerepet játszanak a hagyományos citogenetikai módszerekkel nem kimutatható komplex transzlokációk felismerésében. Emellett a Human Genome Project egyik felfedezése az volt, hogy a kromoszómák telomerekkel szomszédos régiói gazdagok génekben. Mostanra kimutatták, hogy a szubmikroszkópos szubtelomer deléciók felelősek számos genetikailag meghatározott betegség előfordulásáért.

A képződés és növekedés kivétel nélkül minden esetben a HER2 típusú gén aktivitásával függ össze. Ő a felelős azért, hogy mennyi fehérje kerül a női testbe a mellszövet fejlődéséhez. Amikor az első egészséges sejtek rosszindulatúakká degenerálódnak, a génreceptorok információt kapnak arról, hogy a sejtanyag további osztódására van szükség.

A gén elindít egy programot, amellyel további szöveteket növeszt a mell belsejében, bár a valóságban ezt a sejtanyagot fogja a daganat felhasználni a növekedéséhez és fejlődéséhez. Így a karcinóma lényegében megtéveszti a szervezetet, és arra kényszeríti, hogy saját erőforrásai terhére táplálja a rákot.

Az emlőrák halanalízisének feladata éppen a HER2 gén hibás működésének azonosítása és a megfelelő válaszintézkedések megtétele a megfelelő orvosi kezelés előírása érdekében.

Ha nem végez időben haltesztet emlőrák kimutatására, akkor még ha bizonyos gyógyszereket is használnak a kezelés során, ez a daganat agresszív fejlődéséhez vezethet, és egyre több mellszövetet nyel el. Ezek a HER2 gén működésére vonatkozó objektív adatok hiánya miatt helytelenül felírt terápia úgynevezett következményei.

A halelemzés során az orvos speciális anyagokat fecskendez a páciens vérébe, amelyek színező elemeket tartalmaznak, amelyek megjeleníthetik a kromoszóma-rendellenességek képét. Így az orvos tisztán láthatja és utólag tanulmányozza azokat a genetikai rendellenességeket a nő genomjában, amelyek mellrák kialakulásához vezettek.

Ha a HER2 gén rendellenességei igazolódnak, megfelelő kezelést írnak elő. Ha nem, akkor az orvos más tesztek segítségével más okot határoz meg az emlőrák kialakulásához.

A halanalízis másik fontos előnye, hogy a páciens néhány napon belül átfogó jelentést kap az egyik vagy másik betegség kialakulására való genetikai hajlamról. rák. Ennek az orvosi vizsgálatnak a segítségével nemcsak az emlőmirigy, hanem az összes hasi szerv patológiája egyidejűleg diagnosztizálható.

Tájékoztató videó

Pont úgy, mint közben Southern blot nukleotidpróbákat használnak a DNS-fragmensek azonosítására; a citogenetikusok hasonló próbákat használhatnak a kromoszóma-rendellenességek elemzésére. Ennek érdekében a fluoreszcens festékkel jelölt próbákat üveglemezeken fix kromoszómákban található DNS-sel hibridizálják.

Ezt a technikát az ún Fluoreszcencia In Situ hibridizáció (HAL), mivel az interfázisú kromatinban vagy a metafázisos kromoszómákban található, egy helyen (azaz in situ) rögzítve és denaturálva van az üvegen, hogy a kromoszómális DNS-sel hibridizálódó jelölt szondával kezeljék. A szonda fluoreszkál, ha a kromoszómákat olyan hullámhosszú fénnyel világítják meg, amely gerjeszti a fluoreszcens festéket. A hibridizációs jel helyzetét, és így a hibridizált próbával való DNS-szegmens helyzetét mikroszkóposan határozzuk meg.

Általában azért FISH elemzés próbákat használnak - olyan DNS-fragmenseket, amelyek egyedi pozícióval rendelkeznek a kromoszómában. Az ilyen próbák hibridizáción mennek keresztül, és megjelölik a helyét minden homológ kromoszómán, amely megfelel a normál helyzetben szonda szekvenciák. A FISH próba lehet egy egész karból vagy akár egy teljes kromoszómából nyert DNS összetett keveréke is. A próba összetételétől függően a vele való hibridizáció során a teljes kromoszóma vagy annak egy része megjelölődik.

Az ilyen keverékek szondák kromoszómapróbák néven ismertek. Végül 24 különböző kromoszómális szonda, amelyek különböző hullámhosszú fluoreszcens festékek különböző kombinációival vannak megjelölve, kombinálhatók mind a 24 emberi kromoszómához. Minden kromoszómát egy szondával jelölnek meg, amely a fényhullámhosszak sajátos kombinációjával rendelkezik. Mind a 24 kromoszómapróbát kombinálják, és a metafázisú kromoszómák FISH-elemzésére használják. Ezt a technikát spektrális kariotipizálásnak (SKY) nevezik.

Mivel minden kromoszóma-specifikus szondának van fluoreszcencia saját hullámhossz-kombinációjukkal a különböző kromoszómák részeiből álló mutáns kromoszómák SKY-analízissel jól megkülönböztethetők, az átrendeződésben szereplő kromoszómák pedig könnyen azonosíthatók. A FISH-t, amely egyetlen összefüggő nukleotidszekvenciát, kromoszóma-specifikus próbákat és a SKY-módszert használ minden kromoszómára szondák kombinációjával, széles körben használják a klinikai citogenetikában a kromoszóma-rendellenességek, például a deléciók, inszerciók és transzlokalizációk kimutatására.

Az onkológiai patológiák kezelésére a tudósok még nem dolgoztak ki tökéletes terápiás módszereket, amelyek elősegítik a gyógyulást. A mellrák halelemzése reményt ad a betegség korábbi diagnosztizálására. A módszer lehetővé teszi a nők számára, hogy a kezelést a legkorábbi stádiumban kezdjék meg, ami növeli a gyógyulás esélyeit.

Ami?

Az emlőrák halvizsgálata a korai diagnózis egyik progresszív és releváns eszköze. Angolról lefordítva az intracelluláris fluoreszcens hibridizáció tesztjét jelenti. Ezzel a génteszttel az onkológusok elemzik a daganatok eredetét. Az elemzés pozitív ill rossz hatás az agresszív típusú rák patogenezisében és progressziójában szerepet játszó gén - HER2.

A tudományos kutatás folyamatos fejlesztése csökkenti a FISH-teszt költségeit, és egyre több nő számára teszi elérhetővé.

Növekedés nyirokcsomók a hónaljban jelezheti a betegség kialakulását.

• megnagyobbodott nyirokcsomók a hónaljban;
• csomók a mellkas területén;
• fájdalom a mellbimbó megnyomásakor;
• az emlőmirigyek aszimmetriája;
• kellemetlen érzés és fájdalom az egyik mellben;
• mellbimbó váladékozása;
• ráncos bőr a mellen;
• fordított mellbimbó.

Elemzés elkészítése és leadása

A Phish teszt sikeres teljesítéséhez nincs szükség különösebb felkészülésre. Ne igyon alkoholt, csakúgy, mint bármilyen vizsgálat előtt, és egyen zsíros, húsos és nehéz ételeket. Az étel legyen könnyű, jobb, ha zöldségételek és gyümölcslevek. Halteszt mellrákra - ártalmatlan és biztonságos eljárás amely két szakaszban zajlik:

• Szövettani. Alatt helyi hatásÉrzéstelenítés alatt biopsziát vesznek az emlőből. A kapott anyagot speciális festékkel, fluoreszcens markerekkel dolgozzák fel. Kémiai tulajdonságaik alapján ezek a markerek kizárólag a sejtekben kijelölt kromoszómákhoz és azok készleteihez kötődnek. A vizsgálatok eredményeként a markerrel leginkább megfestett kromoszómakészletek láthatók, ami jelzi a genom változásának mértékét a rák szerint.
• Halelemzés. Egy DNS-komponenst, a dezoxiribonukleinsavat, amelyet specifikus markerekkel festenek meg, infundálnak a vénába. A marker címkék sejtszinten integrálódnak a genomokba. A vizsgálatot a beteg jelenlétében végzik el, és az elemzés eredményeit azonnal rendelkezésre bocsátják.

Mit mutatnak az eredmények?

Az emlőmirigy szövettana lehetővé teszi a daganat típusának és megjelenésének okainak meghatározását.

A mellrák halelemzése a következő eredményeket mutatja:

• Szövettani vizsgálat. Az eredmények a kromoszómakészletek területein lévő markerek telítettsége alapján jelennek meg. Az 1 vagy annál kevesebb szám azt jelenti, hogy nincs veszély. A szám egy határfeltételt jelöl, amely további elemzést igényel. A 3-as szám az onkológiai folyamat kialakulását jelzi.
• Halreakció emlőrákban. A negatív reakció eredménye azt jelenti, hogy a dezoxiribonukleinsav molekulák nem vesznek részt az atipikus sejtek patogenezisében. A rosszindulatú daganat kialakulása során a HER2 gén nem befolyásolja a rákos sejtet. Pozitív reakció esetén a rákmolekulák patogenezisében részt vevő gének osztódási sebessége megduplázódik.

A FISH a 21. század molekuláris biológiájának egyik legcsodálatosabb „eszköze”. A preimplantációs diagnosztikában a FISH-kutatási technikát alkalmazzák az in vitro megtermékenyítéssel (IVF) újonnan nyert embrió sejtjeinek kromoszóma-rendellenességeinek vagy kromoszómapárosodási rendellenességeinek kimutatására. Ha nem észlelnek rendellenességet vagy aneuploidiára utaló jeleket (párosodási zavar, kromoszómapárok hiánya), akkor a „mesterséges” embrió életképesnek minősül. A kismama méhébe ültethető.

A FISH lehetővé teszi az embrió kromoszómakészletének szexuális jellemzőinek nyomon követését is. Ez lehetővé teszi a születendő gyermek nemének meghatározását már a tényleges terhesség kezdete előtt (ha azt vesszük, hogy a testen kívül megfogant embrió beültetésével kezdődik a méhbe).

Mi az a FISH?

A rövidítés jelentése: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, vagy fluoreszcens in situ hibridizáció. Az átirat valószínűleg nem mond semmit a tudatlan olvasónak. Ezért az összetett fogalmat részenként elemezzük, az alulfordított „in-situ”-t utoljára hagyva.

Hibridizáció

A molekuláris biológiában ennek a kifejezésnek nagyon különleges jelentése van, aminek semmi köze a fajok keresztezéséhez a „hétköznapi” biológiában.

A hibridizáció egy molekuláris genetikai technika, amelyet a vizsgált sejtek DNS és RNS állapotának felmérésére használnak. A nukleinsavak egyes láncainak egyetlen molekulává történő összekapcsolásán alapul. Ily módon a molekulák vagy fragmentumaik egymáshoz való komplementaritása (kölcsönös megfeleltetése) ellenőrzésre kerül. A teljes komplementaritás mellett a láncok könnyen és gyorsan egyesülnek egy közös molekulává. A lassú egyesülés elégtelen komplementaritást jelez. A láncok nem komplementaritása éppen a kromoszóma-rendellenességeknek (egyes területeken a kromoszómák sorrendjének megsértése), a párosítatlan kromoszómáknak vagy néhány pár hiányának köszönhető.

A komplementaritás mérésének „eszköze” az a hőmérséklet, amelyen a DNS-szálak közös molekulává hibridizálódnak. Ehhez először fel kell melegíteni a nukleinsavkészítményt, majd egy másik felmelegített készítménnyel összekeverve le kell hűteni. Hevítéskor a DNS- vagy RNS-láncok közötti hidrogénkötések eltűnnek, és molekulák egyszálú fragmentumai képződnek. Két DNS vagy RNS (vagy DNS-RNS) vegyes készítményeit lehűtjük. Lehűtve a komplementer bázisok közötti hidrogénkötések gyorsan helyreállnak, és egyetlen hibrid DNS-molekula (RNS vagy DNS - RNS) képződik. A komplementaritás hiányában a folyamat tovább tart, a nem komplementer töredékek nem kapcsolódnak össze. Következésképpen minél magasabb a hibridizációs hőmérséklet, annál harmonikusabb és korrektebb a sejtek kromoszómaszerkezete. Minél alacsonyabb a hőmérséklet, annál több a kromoszómák rendellenessége. A nem komplementer maradványok elemzése alapján specifikus anomáliák vagy aneuploidia területek azonosíthatók.

Fluoreszkáló jelölés

A hibridizálódó DNS (vagy RNS) molekula komplementaritásának elemzésére speciális genetikai próbákat (vagy DNS-próbákat) használnak, amelyek természetesen szintén kevés közös vonást mutatnak például a sebészetben használt névrokonaikkal.

A genetikai próbákat szintetizálják és speciálisan megjelölik egyszálú DNS-t (ritkábban RNS-t), előre meghatározott komplementaritási tulajdonságokkal. Hibridizálva egyesülnek bizonyos genetikai fragmentumokkal, így megerősítve komplementaritásukat. A szondák elhelyezkedése a hibridizált molekulában jelzi az eredeti kromoszómaanyag normális vagy hibás szerkezetét, amelyből ez a „mesterséges szerkezet” összeállt.

A genetikai szondákat különösen világító (fluoreszkáló) anyagokkal látják el, ami egy speciális fluoreszcens mikroszkóp lencséje alatt láthatóvá teszi őket.

Különböző festékek használata több próbához lehetővé teszi a különböző genetikai struktúrák egyidejű elemzését, például a kromoszómák azon régióinak azonosítását, amelyekben két gén egymásra helyeződik, és más anomáliákat is.

Jelenleg egyetlen elemzésben a genetikai próbákat öt-hat különböző színezékkel, néha héttel is megjelölik.

Az in situ jelentése „otthon”

Az eredeti hibridizációs technika nehézkes volt. Az extrahált DNS-t speciális termikus pufferben denaturáltuk, és centrifugában összekevertük más denaturált fragmensekkel. A hibridizációt szintén laboratóriumban, „vegyi edényben” végezték.

A modern technológia lehetővé teszi az elemzések in situ, azaz „helyszínen”, „otthon” elvégzését az eredeti genetikai struktúrákban, nem pedig laboratóriumi készítményekben. A vizsgálat tárgyát maguk a sejtmagok képezték (a poláris testek, a blasztomerek és a blasztociszta felszíni sejtjeinek biopsziája során kivont).

A genetikai anyag közvetlen megfigyelése a sejtmagokban felgyorsítja a folyamatot, ezáltal „tisztább”, mentes a külső hatásoktól és sérülésektől, ami a laboratóriumi gyógyszerek gyártásánál sem kizárt.

Vannak azonban olyan problémák, amelyek áthághatatlan határokat mutatnak ez a módszer. Egyetlen hibridizáció nem tudja „lefedni” a sejtek teljes kromoszómakészletét. Általában két vagy három szekvenciális hibridizációra van szükség, ami lehetővé teszi 12-15 kromoszómapár vizsgálatát (ebből 23 van emberben). A DNS-láncok további hibridizációjának képessége minden egyes rehibridizáció után fokozatosan csökken. Ez nem teszi lehetővé, hogy a hibridizációt „annyiszor, ahányszor kívánjuk” ugyanazon genetikai anyag kimerítő elemzéséhez.