a mikrobiológiában

"Agglutinációs reakció és típusai (RA)"

Terv:

1. Bevezetés………………………………………………………………………………..3

2. RA üvegen………………………………………………………………………………….4

3. RA kémcső………………………………………………………………………………………….5

4. Felhasznált irodalom…………………………………………………………………..7

1. Bemutatkozás.

A mikrobiális antigén és az antitestek kölcsönhatása szigorúan specifikus jellegű, és az állati szervezetben a kórokozó és toxinjainak semlegesítésére irányul. Az antigén és az antitestek in vitro kölcsönhatása bizonyos körülmények között látható jelenségekkel jár (agglutináció, precipitáció, immunlízis), ami lehetővé teszi a szerológiainak (a latin szérumból) nevezett AG-AT reakciók gyakorlati felhasználását. A biogyárak ismert specifikus természetű (diagnosztikai) antigéneket és immunszérumokat (antitesteket) állítanak elő. Az ilyen szérumok szerológiai reakciókban történő felhasználásával lehetőség nyílik egy ismeretlen mikroorganizmus azonosítására, vagy egy ismert antigén felhasználásával a kórokozó bejuttatására válaszul szintetizált antitestek kimutatása a szervezetben, és így diagnózis (szerológiai diagnózis) állítható fel. Ezenkívül szerológiai reakciók segítségével értékelhető az immunválasz intenzitása oltás vagy fertőző betegség után.

Az agglutinációs reakciók, mint például a közvetett agglutináció és a Coombs, a korpuszkuláris antigének és az antitestek in vitro kölcsönhatásán és a keletkező komplexek kicsapódási képességén alapulnak. Korpuszkuláris antigénként a mikroorganizmusokból kivont és a hordozótesteken szorbeált baktériumsejteket vagy oldható antigéneket: vörösvértesteket, latexrészecskéket stb.

A korpuszkuláris antigének antigéndeterminánsai specifikusan kölcsönhatásba lépnek a homológ antitestekkel (a reakció specifikus, láthatatlan fázisa), majd az antigén-antitest komplexek szabad szemmel látható nagy konglomerátumokat képeznek, amelyek kicsapódnak - agglutinátum (a reakció nem specifikus, látható fázisa). ). A mikrobák lobogómentes formái (Brucellae) szemcsés agglutánsokat, míg a flagellált formák (Escherichia, Salmonella) nagyméretű pamut agglutánsokat termelnek, amelyek fordított esernyő formájában a kémcső aljára telepednek, és rázáskor könnyen eltörnek. Az antigének és antitestek csak elektrolit (0,8%-os nátrium-klorid oldat) jelenlétében lépnek kölcsönhatásba. A reakció lefolyását befolyásolja az elektrolit sókoncentrációja, a szuszpenzióban lévő mikrobasejtek száma, a szérumkoncentráció, a pH, a hőmérséklet és egyéb tényezők.

Agglutinációs reakció (ra).

Léteznek specifikus agglutináció, amely az antigén kölcsönhatásán alapul Val vel homológ antitest , az állat testében található, amelybe ezt az antigént bejuttatták (immunagglutináció); nem specifikus (kémiai), a környezet pH-jának, az elektrolitok koncentrációjának változásából eredő; spontán, ami a baktériumok (R-formájú) fiziológiás oldatban való szuszpendálásakor és hevítéskor figyelhető meg, ami a baktériumsejt kolloid állapotának megváltozásával jár. Antigén , Az RA-ban részt vevő agglutinogénnek, az antitestet agglutininnek, a keletkező csapadékot pedig agglutinátnak nevezik. Amikor agglutinát képződik, fontos az antigén és az antitestek mennyiségi aránya (az optimális jelenség). Az antitestek feleslege vagy hiánya esetén A késés lép fel.

Az agglutinációs reakció (RA) az egyik első immunológiai reakció, amelyet a mikrobiológiai gyakorlatban alkalmaznak. F. Vidal először (1895) használta az RA-t a tífusz diagnosztizálására. Később (1897) A. Wright ugyanezt a reakciót alkalmazta az emberek brucellózisának diagnosztizálására. Az RA alkalmazást talált csirkék pullorosisának, leptospirózisának, kancák fertőző vetélésének diagnosztizálásában, valamint ismeretlen mikrobatenyészetek tipizálásában is ismert agglutináló szérum segítségével. Az RA nagyon érzékeny; 0,01 μg antitest fehérje nitrogén kimutatására használható 1 ml-ben.

Az agglutinációs reakciónak számos változatát fejlesztették ki, amelyek módszertani megvalósításában és a vizsgálat céljában különböznek egymástól.

2. Ra üvegen.

Az RA ezen változatában a vizsgálati alanyok lehetnek szérum vagy antigén, de leggyakrabban ezt a lehetőséget használják mikroorganizmusok azonosítására.

1. A mikroorganizmus azonosításához (m/o) egy csepp ismert agglutináló szérumot, például Salmonella szérumot és egy csepp fiziológiás oldatot (kontroll) külön-külön csepegtetünk egy zsírmentes tárgylemezre. Ezután bakteriológiai hurok segítségével a vizsgált tenyészet bakteriális tömegét egy telepről Petri-csészében vagy egy ferde MPA felületéről kémcsőben vesszük ki, és külön szuszpendáljuk immunszérumban és fiziológiás oldatban, amíg homogén szuszpenziót nem kapunk. kapott. Az eredményt 2...4 perc elteltével veszi figyelembe.

Eredmények elszámolása: a kontrollmintában ne legyen változás. Ha a baktériumtenyészet specifikusan egyezik az immunszérummal, agglutinát pelyhek jelennek meg (pozitív eredmény, ha nincs agglutinációs jelenség, arra a következtetésre jutunk, hogy a vizsgált baktériumtenyészet nem felel meg az immunszérumnak).

2. Tekintsük az anittel kimutatását a vizsgált vérszérumban a brucellózis szerodiagnózisában használt rose bengal teszt példáján. 0,3 ml vizsgált állati vérszérumot és 0,03 ml brucellózis antigént (rózsa-bengáliával festett Brucella-sejtek) viszünk fel egy tárgylemezre. A komponenseket az üveg rázatásával alaposan összekeverjük, és az eredményt 4 perc elteltével figyelembe veszik.

Az eredmények rögzítése: ha a reakció pozitív, rózsaszín agglutinát pelyhek jelennek meg. Az ilyen típusú szerológiai reakciók kvalitatívnak minősülnek, mivel segítségével kimutathatóak a kórokozó elleni antitestek az állat vérszérumában, de mennyiségi tartalmuk nem értékelhető.

Az agglutinációs reakció az antitestek (agglutininek) specifikus kölcsönhatásán alapul teljes mikrobiális vagy más sejtekkel. E kölcsönhatás eredményeként agglomerátum részecskék képződnek, amelyek kicsapódnak (agglutinálódnak). Baktériumok, protozoonok, gombák, élesztőgombák, rickettsia, eritrociták és más élő és elpusztult sejtek is részt vehetnek az agglutinációs reakcióban. A reakció két fázisban megy végbe: az első az antigén és az antitest specifikus kombinációja, a második a nem specifikus, azaz látható agglutinát képződése. Az agglutinát kiválása elektrolitok, például nátrium-klorid jelenlétében történik. Az agglutinátumban lévő mikroorganizmusok életben maradnak, de elveszítik mobilitásukat.

Az agglutinációs reakciót széles körben használják szerológiai diagnosztikában fertőző betegségek valamint izolált mikrobák antigén szerkezetének meghatározása. A páciens vagy hordozó testéből izolált kórokozó antigén szerkezetének meghatározására specifikus immunszérumot használnak, amelyet állatok (nyúl, szamár, juh) bizonyos mikroorganizmusokkal történő immunizálásával nyernek. A mikroba azonosítása agglutinációs reakcióban történik üvegen adszorbeált vagy monoreceptor szérummal, vagy kémcsövekben specifikus agglutináló szérummal. Az adszorbeált szérumok csak egy adott mikrobára specifikus antigének ellen tartalmaznak antitesteket, a monoreceptor szérumok pedig csak egy antitestet tartalmaznak. specifikus antigén kórokozó.

A fajszérumok antitesteket tartalmaznak egy adott mikroba összes antigénje ellen.

Egy izolált mikroorganizmus-tenyészet adott fajhoz való tartozását ismert szérummal végzett agglutinációval határozzuk meg a szérumampulla címkéjén feltüntetett antitest-titerhez. A szérum antitest-titerét az utolsó hígításnak tekintik, amelyben még mindig megfigyelhető az állat immunizálására használt mikrobatenyészet agglutinációja. Az adszorbeált és monoreceptor szérumokat általában hígítatlanul használjuk az üvegagglutinációs reakcióban.

Az antitestek jelenlétének meghatározásakor a páciens vérszérumában izotóniás nátrium-klorid-oldattal hígítjuk, 1:50-től 1:800-ig vagy nagyobb hígításból kiindulva. Élő vagy elölt mikrobák szuszpenzióját adjuk minden hígításhoz. A hővel vagy formaldehiddel elpusztult mikrobákat tartalmazó készítményeket diagnosztizálják. A mikroorganizmus-tenyészetek melegítésével kapott diagnosztikai anyagok csak szomatikus antigéneket tartalmaznak. Ha csak formaldehidet használunk, a mikrobák megtartják flagelláris antigénjeiket.

Ha a páciens vérében antitestek vannak jelen, a reakcióban vett diagnosztikai teszt összetapad, és két kémcsőben csapadék (agglutinátum) képződik. Ebben az esetben az agglutinációs reakció eredménye pozitívnak tekinthető. A kontroll csőben, amelybe izotóniás nátrium-klorid oldatot és diagnosztikát adunk, a mikrobák szuszpenziója homogén legyen (negatív agglutinációs reakció).

Az agglutinációs reakció eredményeit egyes betegségekben, például a leptospirózisban csak mikroszkóposan, a mikroszkóp sötét látómezejében veszik figyelembe (mikroagglutináció). A betegség szerológiai diagnózisának felállításához vegye figyelembe diagnosztikai betegség. Általában 1:100 vagy 1:200 szérumhígításnak felel meg.

Az agglutinációs reakció segítségével kimutathatók a páciens vérszérumában lévő antitestek tífusz és paratífusz (Vidal-reakció), brucellózis (Wright-reakció), tularémia stb. esetén.
Castellani reakciója. Bizonyos fertőző betegségek vagy mikroorganizmusokat tartalmazó immunizálás esetén csoportos antigének, a vérszérumban az erre a típusra specifikus antitestek mellett csoportos antitestek is megjelennek. Ebben az esetben a rokon baktériumfajokat agglutinálja a keletkező szérum.

Castellani egy módszert javasolt a csoportos antitestek immunszérumból való adszorpciójára, amely a rokon fajokhoz tartozó mikroorganizmusok segítségével való eltávolításukra épül, amelyek rendelkeznek csoportantigénekkel, de nem rendelkeznek specifikus antigénekkel. A szérumhoz hozzáadott ilyen mikroorganizmusok tenyészete adszorbeálja a nem specifikus antitesteket, és az antigén-antitest komplex centrifugálással történő eltávolítása után csak specifikus immunglobulinok maradnak a szérumban. A Castellani-módszer szerint feldolgozott szérumok az agglutinációs reakcióban rendkívül specifikusakként használhatók fel.

Cél: Sajátítsa el a fertőző betegségek diagnosztizálására szolgáló agglutinációs reakciók és precipitációs reakciók végrehajtásának technikáját.

1. modul. A mikroorganizmusok morfológiája és élettana. Fertőzés. Immunitás.

16. téma: Agglutinációs reakció. Csapadék reakció.

A téma relevanciája. Alatt immunitás a szervezet immunitását jelenti a fertőző és nem fertőző ágensekkel szemben ( patogén mikroorganizmusok, idegen fehérjék és egyéb anyagok). Ezeket a szereket antigéneknek nevezzük. Az immunitás lehet veleszületett vagy szerzett. Veleszületett– amikor szöveti és humorális védőeszközök képződnek, immunitást okozva az öröklődés útján terjedő fertőző betegségekkel szemben.

Szerzett– a szervezet immunrendszere végzi antitestek termelése vagy szenzitizált limfociták felhalmozódása formájában. Ez fel van osztva természetes és mesterséges. A hatásmechanizmus szerint fel van osztva aktív és passzív. Mindenben immunológiai reakciók a fő komponens az antigén.

Fő funkció immunrendszer, amely abból áll limfoid szövet, az idegen ágensek (antigének) felismerése és semlegesítése.

Az antigének ezen keresztül juthatnak be a szervezetbe Légutak, emésztőrendszer, a bőrön és a nyálkahártyán keresztül. Mindegyik antigén serkenti a speciális fehérjeanyagok - antitestek - képződését.

Antigének teljes és alsóbbrendű (haptén) részekre oszlanak. Komplett antigének teljes immunválaszt váltanak ki. Hibás antigénekÖnmagukban nem indukálnak immunválaszt, de néha nagy molekulatömegű fehérjehordozókkal konjugálva sajátítják el ezt a képességet. Ezenkívül vannak antigének: hemihaptének, proantigének, heteroantigének és izoantigének.

Antitestek emberi vagy állati vérszérumból származó immunglobulinok. Az antitestek fertőzés után, valamint legyengült vagy elpusztult baktériumokkal, rickettsiával, vírusokkal, toxinokkal és más szerekkel végzett immunizálás eredményeként képződnek. Antitestek- immunglobulin fehérjék kémiai összetétel glikoproteinekhez tartoznak. Szerkezetük és immunbiológiai tulajdonságaik alapján az immunglobulinokat a 5 osztály: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Normál antitestek nem immunizált emberekben és állatokban találhatók meg. Specifikus antitestek fertőzés vagy immunizálás eredményeként jönnek létre.

Az antitest és az antigén közötti reakciót ún szerológiai. A szerológiai tesztek nagyon specifikusak, és számos fertőző betegség diagnosztizálására használják. Különbséget tesznek az agglutinációs és a kicsapódási reakciók között.

1. Agglutinációs reakció (RA) egy antigén (agglutinogén) és egy antitest (agglutinin) kölcsönhatásán alapul, amelyben a mikrobatestek összetapadnak és elektrolit jelenlétében kicsapódnak. Az agglutinációs reakciónak különféle módosításai vannak.

Legmagasabb érték rendelkezik:

- Makroszkópos (expandált) agglutináció kémcsövekben. Mikrobák szuszpenzióját (diagnosticum) adjuk a páciens szérumához, és 1 óra elteltével 37 fokos termosztátban fel kell jegyezni a szérum hígítását (titerét), amelynél a reakció bekövetkezett. Az agglutinációs reakció akkor tekinthető pozitívnak, ha a kémcső alján csapadék képződik a felülúszó folyadék határozott kitisztulásával. Ezt a csapadékot agglutinátumnak nevezik.

Az agglutinátum jellege alapján megkülönböztetünk finomszemcsés (O) és durvaszemcsés (H) agglutinációt. A finomszemcsés agglutinátum azonosítására agglutinoszkópot használnak. Az eredmények rögzítése kontrollcsövekkel kezdődik. A szérum utolsó hígítását, amelyben agglutináció figyelhető meg, a titerének tekintjük.

A reakció célja: antitestek kimutatása a beteg szérumában.

- Mikroszkópos (gyorsított ) hozzávetőleges agglutináció üvegen. Egy csepp bakteriális tenyészetet adunk egy csepp diagnosztikai immunszérumhoz, és egyenletesen elkeverjük. A reakció szobahőmérsékleten 5-10 perc alatt megy végbe. Ezután megtörténik a könyvelés. Ha a reakció pozitív, a baktériumok szemcsék vagy pelyhek formájában felhalmozódását észlelik a szérumcseppben. A reakció célja: a kórokozó típusának meghatározása ismert diagnosztikai szérum segítségével.

- Közvetett (passzív) hemagglutinációs reakció (IRHA). Ennek a reakciónak az a lényege, hogy a birka vörösvértestjei képesek adszorbeálni az antigéneket a felületükön. Specifikus antitestek hatására a vörösvértestek összetapadnak és kicsapódnak, alul hemagglutinátot képezve. A reakció nagyon érzékeny és specifikus. Az RNGA lehetővé teszi minimális mennyiségű antitest és poliszacharid jellegű hibás antigének kimutatását. Ezt a reakciót számos fertőző betegség (tífusz és tífusz, paratífusz, tuberkulózis stb.) diagnosztizálására használják.

2. Kicsapási reakció (RP ) – az antigén-antitest komplex kicsapása. A fő különbség az RP és az RA között, hogy az RA-ban korpuszkuláris antigént használnak, míg az RP-ben az antigén egy fehérje vagy poliszacharid jellegű kolloid anyag. Ebben a reakcióban az antigént precipitinogénnek, az antitesteket pedig precipitinnek nevezik. A reakciót kémcsövekben hajtjuk végre úgy, hogy az antigénoldatot az immunszérumra rétegezzük. Az antigén és az antitestek optimális arányával a határon

Ezek az oldatok csapadékgyűrűt képeznek. Ha a szervek és szövetek főzött és szűrt kivonatait antigénként használják, a reakciót hőkicsapódási reakciónak nevezik (Ascoli-reakció, amelyet lépfene, pestis, tularémia stb. diagnosztizálására használnak).

Az agar kicsapódási reakciói széles körben elterjedtek: egyszerű diffúziós módszer, kettős diffúziós módszer.

A csapadék egy fajtája az flokkulációs reakció– toxoid vagy antitoxikus szérum aktivitásának meghatározására. Ezenkívül ez a reakció felhasználható a Corynebacterium diphtheriae törzsek toxicitásának meghatározására.

Konkrét célok:

· Ismertesse az antigének, mint immunválasz indukálói szerepét;

· Ismertesse az antigének szerkezetét, beleértve a mikroorganizmusok antigénjeit is;

· Ismertesse az agglutinációs reakció mechanizmusát;

· Ismertesse a kicsapódási reakció mechanizmusát!

Képesnek lenni:

· Ismertesse az antigének, mint immunválasz indukálói szerepét;

· Ismertesse az antitestek szerkezetét (az immunglobulinok különböző osztályai);

· Az antitestek antigénekkel való kölcsönhatásának mechanizmusának elemzése;

· Értelmezze az agglutinációs reakció eredményeit;

· Értelmezze a kicsapódási reakció eredményeit;

· A kapott eredmények elemzése.

Elméleti kérdések:

1. Az „antigének”, „antitestek” fogalmának meghatározása.

2. Az antigének szerepe az immunválasz indukálóiként.

3. Az antitestek szerkezete (az immunglobulinok különböző osztályai).

4. Az antitestek antigénekkel való kölcsönhatásának mechanizmusa.

5. Immunreakciók, szerepük az immunválaszban és a fertőző betegségek diagnosztizálásában.

6. Az agglutinációs reakció mechanizmusa.

7. A kicsapódási reakció mechanizmusa.

Az órán végrehajtott gyakorlati feladatok:

1. Agglutinációs reakció végrehajtása a páciens szérumában lévő antitestek kimutatására.

2. Mikroagglutinációs reakció felállítása üvegen diagnosztikai szérummal a tiszta baktériumkultúra azonosítására.

3. Az agglutinációs reakció eredményeinek értékelése.

4. Kicsapási reakció beállítása bakteriális antigén kimutatására.

5. A kicsapási reakció eredményeinek értékelése.

6. Az indirekt hemagglutinációs reakció eredményeinek értékelése.

7. A jegyzőkönyv készítése.

Irodalom:

1. Pyatkin K.D., Krivoshein Yu.S. Mikrobiológia virológiával és immunológiával – Kijev: elvégezni az iskolát, 1992.- 431 p.

2. Vorobjov A.V., Bykov A.S., Pashkov E.P., Rybakova A.M. Mikrobiológia.- M.: Orvostudomány, 1998.- 336 p.

3. Orvosi mikrobiológia /Szerk.: V.P. Pokrovsky – M.: GEOTAR-MED, 2001. – 768 p.

4. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Orvosi mikrobiológia, immunológia és virológia / Tankönyv a orvosi egyetemek, Szentpétervár: „Speciális irodalom”, 1998.- 592 p.

5. Timakov V.D., Levashev V.S., Borisov L.B. Mikrobiológia / Tankönyv - 2. kiadás, átdolgozott. és további – M.: Orvostudomány, 1983.- 512 p.

6. Előadási jegyzetek.

További irodalom:

1. Titov M.V. Fertőző betegségek.- K., 1995.– 321 p.

2. Shuvalova E.P. Fertőző betegségek – M.: Orvostudomány, 1990.- 559 p.

Agglutinációs reakció Agglutinációs reakció

Az (RA) egy módszer az Ag és Ab azonosítására és mennyiségi meghatározására, azon képességük alapján, hogy szabad szemmel látható agglomerátumokat képeznek. A fertőző betegségek osztályán. betegségek vagy egyéb célokra használják az ismeretlen mikrobák és sejtek azonosítására, az Ab jelenlétének és mennyiségének meghatározására a vérben és más folyadékokban. A meghatározási elv az Ag és Ab közötti kölcsönhatás specifikusságán alapul, és abból áll, hogy az ismertet az ismeretlentől megtaláljuk. Az RA-ra számos lehetőség kínálkozik: mennyiségi és minőségi, kémcső és üveg, volumetrikus és cseppes, hagyományos, gyorsított és expressz módszerek. Az RA színpadra állításához szüksége van: 1) s-ka vér. A baktérium típusának (var) meghatározására szolgáló változatban ipari agglutinációs teszteket alkalmaznak, amelyeket nyulak immunizálásával állítanak elő. Az Ab típusának meghatározásával rendelkező változatban a tesztből vérmintát vesznek. emberek vagy állatok. Az oldatnak sterilnek és lebegő részecskéktől mentesnek kell lennie. Készítse elő az alaphígítást sóoldatban. 2-4-szer alacsonyabbnak kell lennie, mint a betegség diagnosztikai titere; 2) Ag. Az Ab-típus meghatározásával végzett reakció változatban ipari diagnosztikai készleteket használnak; Az Ag meghatározásával rendelkező változatban a diagnosztikai anyagokat 18-20 órás agar (ritkábban húsleves) teszt sóoldatban 1-3 milliárd szuszpenzió formájában készítik elő. mikroba inaktivált vízfürdőben 70 °C-on 1 órán át vagy 24 órás inkubálással 37 °C-on formaldehiddel (végső koncentráció 0,2%); 3) elektrolit sóoldat formájában. Színpadi technika volumetrikus soros cső RA az s-ki Ab-titer meghatározásához: az s-ki főhígításából több sor munkahígítást készítünk. A sorok száma a kísérletbe vett diagnosztikai anyagok számától függ, a számot és a hígítási faktorokat a gyanús betegség diagnosztikai titere határozza meg. A sorozatnak legalább a diagnosztikai Ab-titernek megfelelő hígítást kell tartalmaznia, két hígítást alatta és két hígítást felette. például ha a diagnosztikai titer 1:100, akkor az RA staging volumetrikus módszerével a következő hígításokat kell elkészíteni: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; csepegtetővel módszer szerint az első hígítás (1:25) nem szükséges, de egy másik magasabb hígítás szükséges - 1:800 B. tudományos kutatás Az s-ku-t negatív reakcióra titráljuk. A következőképpen hígítjuk: az 1. kivételével minden kémcsőbe 0,25 ml sóoldatot öntünk, ha a reakciót 0,5 ml-es térfogatban hajtjuk végre, és 0,5 ml-t, ha a reakciót 1 ml térfogatban hajtjuk végre. ml. Öntsön a főhígításból 0,25 (0,5) ml-t az 1. és 2. kémcsőbe, a 2. kémcsőből a vágott térfogatba és tenyésztés s-kés 2-szeresére növelve 0,25 (0,5) ml-t viszünk át a 3-ra, a 3-ról a 4-re stb. az utolsóig a vágásból 0,25 (0,5) ml-t öntünk mindenbe, hogy egyensúlyba kerüljenek a térfogatok. Minden hígítást külön pipettával végeznek. Ha több diagnosztikát veszünk kísérletbe, akkor mindegyikhez ugyanúgy elkészítjük a saját hígítási sorozatát. A Diagnosticumot a kémcső minden hígításához a kémcső térfogatával megegyező térfogatban adjuk, aminek eredményeként a hígítás minden kémcsőben megduplázódik. A kísérlet megfelel az s-ki kontrollnak (0,25 - 0,5 ml s-ki főhígítás és ugyanennyi sóoldat) és az Ag kontrollnak (0,25 - 0,5 ml diagnosticum és ugyanennyi sóoldat). Ha több diagnosztikát használunk a kísérletben, akkor mindegyiknek megvan a saját antigénkontrollja. A kémcsövekkel ellátott állványt jól felrázzuk, és 4 órára 37°C-os termosztátba helyezzük, majd másnapig szobahőmérsékleten hagyjuk, majd az üledék mennyisége és a kitisztulás mértéke alapján rögzítjük a PA-t. a folyadékot. Ezen mutatók meghatározását az agglutinátumok természetétől függően szabad szemmel, sötét háttéren, agglutinoszkóppal vagy mikroszkóptükör homorú felületén végezzük. Az elszámolás kontrollokkal kezdődik: a C kontroll legyen átlátszó, az Ag egyenletesen zavaros legyen (a cső rázása után). Ha a kontrollok jók, állapítsa meg az agglutináció jelenlétét és mértékét minden kémcsőben, amelyet pluszokkal jelölnek: nagy üledék és a folyadék teljes kitisztulása - 4 plusz; nagy üledék és a folyadék hiányos tisztítása - 3 plusz; észrevehető üledék és a folyadék észrevehető kitisztulása 2 plusz. Ezt követően meghatározzuk a titert: a legmagasabb hígítást, legalább 2 plusz agglutinációs intenzitással. Titer kutatás s-ki-t a betegség diagnosztikai titerével hasonlítják össze. Ha a titert vizsgáljuk. s-ki 2-szer alacsonyabb, mint a diagnosztikai érték, a reakciót kétesnek értékeljük; ha a titer megegyezik a diagnosztikai értékkel - gyengén pozitív; ha 2-4-szer nagyobb, akkor pozitívnak számít, ha 8-szor nagyobb, akkor élesen pozitívnak számít. Az Ab széleskörű elterjedésével egészséges emberek Az RA értékelésére az Ab titerének növelését alkalmazzák. A soros RA-ban az Ar típusának meghatározásához a sorok számának meg kell egyeznie az azonosításhoz használt számmal diagnosztikai tesztek. A diagnosztikai teszt főhígításából az Ab-titer meghatározásához egymást követő kétszeres hígítások sorozatát készítjük el ugyanúgy, mint az RA-ban. A hígítási faktorok az agglutináló teszt titerétől függenek A kísérletben a teszt titerével megegyező hígítás jelenléte szükséges, valamint annak 2, 4, 6, 8-szor alacsonyabb értéke A diagnosztikai teszt titere 1 3200, akkor az 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 hígításokat kell használni. Ugyanennyi vizsgált Ag-t adunk a teszt hígításaihoz, ennek eredményeként a hígítás a teszt 2-szeresére nő, ha a kísérletben több s-k is részt vesz, akkor a reakció befejeztével az állványt erőteljesen megrázzuk 37 °C-on termosztátban. Az eredményeket a fentiek szerint figyelembe vesszük. A kísérletet figyelembe véve a reakció titerének meg kell felelnie a standard diagnosztikai teszt titerének legalább a felének. Az 1 4 és az alatti titereket csoportreakciónak tekintjük Csepp md Az RA stádiumba állítása abban különbözik a volumetrikustól, hogy az s-ku-t 1 ml térfogatban hígítjuk, az Ag-t nagyobb koncentrációban (10 milliárd/ml) használjuk, és hozzáadunk 1 - 2 cseppek a kémcsőbe A gyógyszer hígítása az Ag hozzáadása után változatlannak tekinthető

(Forrás: Dictionary of Microbiology Terms)

13.1. Antigén-antitest reakciók és alkalmazásaik

Amikor egy antigént bevezetnek, antitestek képződnek a szervezetben. Az antitestek komplementerek a szintézisüket kiváltó antigénnel, és képesek kötődni hozzá. Az antigének antitestekhez való kötődése két fázisból áll. Az első fázis specifikus, amelyben az antigéndetermináns gyorsan kötődik az antitestek Fab-fragmensének aktív centrumához. Meg kell jegyezni, hogy a kötődés a van der Waals-erők, a hidrogén és a hidrofób kölcsönhatások következménye. A kötés erősségét az ellenanyag aktív helye és az antigén epitópja közötti térbeli megfelelés mértéke határozza meg. A specifikus fázis után egy lassabb fázis kezdődik - nem specifikus, ami látható fizikai jelenségben nyilvánul meg (például pelyhek képződése az agglutináció során stb.).

Az immunreakciók az antitestek és az antigének közötti kölcsönhatások, amelyek specifikusak és nagyon érzékenyek. Széles körben használják őket orvosi gyakorlat. Az immunreakciók segítségével a következő problémák oldhatók meg:

Ismeretlen antitestek meghatározása ismert antigénekkel (antigenic diagnosticum). Ez a feladat akkor fordul elő, ha meg kell határozni a kórokozó elleni antitesteket a páciens vérszérumában (szerodiagnózis). Az antitestek megtalálása lehetővé teszi a diagnózis megerősítését;

Ismeretlen antigének meghatározása ismert antitestek (diagnosztikai szérum) segítségével. Ezt a vizsgálatot a páciens anyagából izolált kórokozó tenyészet azonosításakor (szerotipizálás), valamint a

mikrobiális antigének és toxinjaik a vérben és más biológiai folyadékokban. Sokféle immunreakció létezik, amelyek a stádiumba adás technikájában és a rögzített hatásban különböznek egymástól. Ezek az agglutinációs reakciók (RA), a precipitációs reakciók (RP), a komplementet tartalmazó reakciók (RSC), a jelölt komponenseket használó reakciók (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Agglutinációs reakció

Az agglutinációs reakció (RA) egy antigén és antitestek kölcsönhatásának immunreakciója elektrolitok jelenlétében, és az antigén korpuszkuláris állapotban van (vörösvérsejtek, baktériumok, latex részecskék adszorbeált antigénekkel). Az agglutináció során a korpuszkuláris antigéneket antitestek ragasztják össze, ami flokkuláló csapadék képződésében nyilvánul meg. A pelyhek képződése annak köszönhető, hogy az antitesteknek két aktív centruma van, és az antigének polivalensek, azaz. számos antigén-determinánssal rendelkezik. Az RA a beteg anyagából izolált kórokozó azonosítására, valamint a kórokozó elleni antitestek kimutatására szolgál a páciens vérszérumában (például a Wright és Heddleson-reakciók brucellózis esetén, a Widal-reakció tífuszés paratífusz).

Az RA diagnosztizálásának legegyszerűbb módja az üvegen végzett reakció. Ez egy hozzávetőleges RA, amely a betegből izolált kórokozó meghatározására szolgál. Ha a reakció létrejött, diagnosztikai agglutináló szérumot viszünk egy tárgylemezre (1:10 vagy 1:20 hígításban), majd hozzáadjuk a beteg tenyészetét. Pozitív a reakció, ha flokkuláló üledék jelenik meg a cseppben. A közelben kontrollt helyezünk el: szérum helyett egy csepp nátrium-klorid oldatot alkalmazunk. Ha a diagnosztikai agglutináló szérum nincs adszorbeálva 1, akkor azt hígítják (a titerre - arra a hígításra, amelyre az agglutinációnak meg kell történnie), azaz. tegye a kiterjesztett RA-t a kémcsövekbe, növelve

1 Az adszorbeálatlan agglutináló szérum képes agglutinálni a rokon baktériumokat, amelyek közös (keresztreagáló) antigénekkel rendelkeznek. Ezért használnakadszorbeált agglutináló szérum, amelyből a keresztreagáló antitesteket rokon baktériumokhoz való adszorpció útján távolították el. Az ilyen szérumok olyan antitesteket tartanak meg, amelyek csak egy adott baktériumra specifikusak.

agglutináló szérum hígításai, amelyhez a betegtől izolált kórokozó szuszpenziójából 2-3 cseppet adunk. Az agglutinációt az üledék mennyisége és a kémcsövekben lévő folyadék kitisztulási foka veszi figyelembe. A reakció akkor tekinthető pozitívnak, ha a diagnosztikai szérum titeréhez közeli hígításban agglutináció figyelhető meg. A reakciót kontrollok kísérik: az izotóniás nátrium-klorid oldattal hígított szérum legyen átlátszó, a mikrobaszuszpenzió ugyanabban az oldatban legyen egyenletesen zavaros, üledékmentes.

A kórokozó elleni antitestek meghatározásához a páciens vérszérumában teljes körű RA-t alkalmaznak. Felállításkor a páciens vérszérumát kémcsövekben hígítják, és azonos mennyiségű diagnosztizált szuszpenziót (elölt mikrobák szuszpenziója) adnak a kémcsövekbe. Inkubálás után meghatározzuk azt a legmagasabb szérumhígítást, amelynél agglutináció történt, pl. csapadék (szérumtiter) keletkezett. Ebben az esetben az O-diagnosticummal (melegítés hatására elpusztult baktériumok, megtartva a hőstabil O-antigént) az agglutinációs reakció finomszemcsés agglutináció formájában megy végbe. Az agglutinációs reakció H-diagnosticummal (formaldehid által elpusztított baktériumok, megtartva a termolabilis flagelláris H-antigént) durva és gyorsabban megy végbe.

Közvetett (passzív) hemagglutinációs reakció(RNGA vagy RPGA) az RA egy típusa. Ez a módszer nagyon érzékeny. Az RNGA segítségével két probléma oldható meg: antitestek meghatározása a páciens vérszérumában, amelyhez hozzáadódik egy antigén eritrocita diagnosztikum, amely olyan eritrociták, amelyeken ismert antigének adszorbeálódnak; meghatározza az antigének jelenlétét a vizsgált anyagban. Ebben az esetben a reakciót néha fordított indirekt hemagglutinációs reakciónak (RONHA) is nevezik. Az eljárás során a vizsgálati anyaghoz antitest erythrocyte diagnosticum (eritrociták, amelyek felületén antitestek adszorbeálódnak) adunk. Ebben a reakcióban a vörösvérsejtek hordozóként működnek, és passzívan részt vesznek az immunaggregátumok képződésében. Pozitív reakció esetén a passzívan ragasztott vörösvértestek a lyuk alját egyenletes rétegben fedik le, csipkézett szélekkel („esernyő”); agglutináció hiányában a vörösvértestek felhalmozódnak a lyuk központi mélyedésében, és kompakt „gombot” alkotnak, élesen meghatározott szélekkel.

Koagglutinációs reakció a kórokozó sejtek (antigének) meghatározására szolgál adszorbeált antitestek segítségével Staphylococcus aureus, A protein A affinitást mutat az immunglobulinok Fc fragmentumához. Ennek köszönhetően az antitestek az Fc-fragmensen keresztül közvetetten kötődnek a staphylococcushoz, a Fab-fragmensek pedig kifelé irányulnak, és képesek kölcsönhatásba lépni a betegekből izolált megfelelő mikrobákkal. Ebben az esetben pelyhek képződnek.

Hemagglutinációs gátlási reakció (HAI) diagnosztikában használják vírusos fertőzések, és csak a hemagglutináló vírusok által okozott fertőzések. Ezek a vírusok egy fehérjét tartalmaznak a felületükön - a hemagglutinint, amely felelős a hemagglutinációs reakcióért (HRA), amikor vörösvérsejteket adnak a vírusokhoz. Az RTGA magában foglalja a vírusantigének antitestekkel történő blokkolását, aminek következtében a vírusok elveszítik a vörösvérsejtek agglutináló képességét.

Coombs reakció - RA a nem teljes antitestek meghatározására. Egyes fertőző betegségekben, például brucellózisban, a beteg vérszérumában kering hiányos antitestek a kórokozóhoz. A nem teljes antitesteket blokkoló antitesteknek nevezzük, mivel egy antigénkötő helyük van, és nem kettő, mint a teljes antitesteknek. Ezért, amikor antigéndiagnosztikát adnak hozzá, a hiányos antitestek az antigénekhez kötődnek, de nem ragasztják őket össze. A reakció megnyilvánulásához antiglobulin szérumot (humán immunglobulinok elleni antitestek) adnak hozzá, ami a reakció első szakaszában képződött immunkomplexek (antigéndiagnosztika + hiányos antitestek) agglutinációjához vezet.

Az indirekt Coombs-reakciót olyan betegeknél alkalmazzák intravascularis hemolízis. E betegek egy részében hiányos monovalens Rhesus elleni antitesteket mutatnak ki. Kifejezetten kölcsönhatásba lépnek az Rh-pozitív eritrocitákkal, de nem okozzák agglutinációjukat. Ezért antiglobulin szérumot adnak az anti-Rh antitestek + Rh-pozitív eritrociták rendszeréhez, ami az eritrociták agglutinációját okozza. A Coombs-tesztet diagnosztizálják kóros állapotok, immun eredetű eritrociták intravaszkuláris lízisével kapcsolatos, például újszülöttek Rh-konfliktus okozta hemolitikus betegsége.

RA vércsoportok meghatározására alapja a vörösvértestek agglutinációja az A(II), B(III) vércsoport-antigénekkel szembeni immunszérum antitestek által. A kontroll az antitesteket nem tartalmazó szérum, azaz. szérum AB(IV) vércsoport, valamint az A(P) és B(III) csoport vörösvérsejt antigénjei. A 0(I) csoportba tartozó vörösvértesteket negatív kontrollként használják, mivel nem rendelkeznek antigénekkel.

Az Rh faktor meghatározásához anti-Rh szérumokat használnak (legalább két különböző sorozat). Ha a vizsgált eritrociták membránján Rh-antigén található, ezek a sejtek agglutinációt okoznak.

13.3. Csapadék reakció

Az RP az antitestek antigénekkel való kölcsönhatásának immunreakciója elektrolitok jelenlétében, és az antigén oldható állapotban van. A kicsapás során az oldható antigének antitestekkel kicsapódnak, ami felhősödésben nyilvánul meg kicsapódási sávok formájában. Látható csapadék képződése figyelhető meg, ha mindkét reagenst egyenértékű arányban keverjük össze. Egyikük feleslege csökkenti a kivált immunkomplexek számát. A csapadékreakció végrehajtásának többféle módja van.

Gyűrűs kicsapódási reakció kis átmérőjű csapadékcsövekbe helyezzük. Az immunszérumot a kémcsőbe adjuk, és az oldható antigént óvatosan rétegezzük. Ha az eredmény pozitív, a két oldat határfelületén tejszerű gyűrű képződik. A gyűrűs precipitációs reakciót, amely az antigének jelenlétének meghatározására szolgál a szervekben és szövetekben, amelyek kivonatát felforralják és szűrik, hőkicsapási reakciónak (Ascoli-reakció a hőstabil lépfene-antigén meghatározására) nevezik.

Ouchterlony kettős immundiffúziós reakció. Ezt a reakciót agargélen hajtjuk végre. Egy egyenletes vastagságú gélrétegben egymástól bizonyos távolságra lyukakat vágunk ki, és megtöltjük antigénnel, illetve immunszérummal. Ezt követően az antigének és antitestek bediffundálnak a gélbe, találkoznak egymással és immunkomplexeket képeznek, amelyek a gélben kicsapódnak és precíziós vonalakként válnak láthatóvá.

táplálás. Ez a reakció felhasználható ismeretlen antigének vagy antitestek azonosítására, valamint a különböző antigének közötti hasonlóság tesztelésére: ha az antigének azonosak, akkor a precipitációs vonalak összeolvadnak, ha az antigének nem azonosak, a kicsapási vonalak metszik egymást, ha az antigének részben vannak. azonos, sarkantyú keletkezik.

Radiális immundiffúziós reakció. Az olvadt agargélhez antitesteket adunk, és a gélt egyenletes rétegben felvisszük az üvegre. A gélben lyukakat vágunk ki, és standard térfogatú különböző koncentrációjú antigénoldatokat adunk hozzájuk. Az inkubáció során az antigének sugárirányban diffundálnak a lyukból, és az antitestekkel találkozva kicsapógyűrűt alkotnak. Amíg az antigén feleslegben marad a lyukban, a kicsapógyűrű átmérője fokozatosan növekszik. Ezt a módszert a vizsgálati oldatban lévő antigének vagy antitestek meghatározására használják (például a különböző osztályokba tartozó immunglobulinok koncentrációjának meghatározására a vérszérumban).

Immunelektroforézis. Az antigénkeveréket először elektroforetikusan elválasztjuk, majd a fehérje mozgási iránya mentén futó barázdába kicsapó antiszérumot adunk. Az antigének és antitestek egymás felé diffundálnak a gélbe; kölcsönhatásban íves csapadékvonalakat alkotnak.

Flokkulációs reakció(Ramon szerint) - egyfajta kicsapódási reakció, amelyet az antitoxikus szérum vagy toxoid aktivitásának meghatározására használnak. A reakciót kémcsövekben hajtjuk végre. Abban a kémcsőben, ahol a toxoid és az antitoxin egyenlő arányban van jelen, zavarosság figyelhető meg.

13.4. Komplement rögzítési reakció

Az antitestek, amelyek kölcsönhatásba lépnek a megfelelő antigénnel, megkötik a hozzáadott komplementet (1. rendszer). A komplementkötés indikátora a hemolitikus szérummal érzékenyített eritrociták, azaz. vörösvérsejtek elleni antitestek (2. rendszer). Ha a komplement nincs rögzítve az 1. rendszerben, pl. Ha az antigén-antitest reakció nem következik be, az érzékeny vörösvértestek teljesen lizálódnak (negatív reakció). Ha a komplementet az 1. rendszer immunkomplexei rögzítik szenzitizált eritrociták hozzáadása után, hemolízis

hiányzik (pozitív reakció). A komplementkötési reakciót fertőző betegségek (gonorrhoea, szifilisz, influenza stb.) diagnosztizálására használják.

13.5. Semlegesítési reakció

A mikrobák és méreganyagaik káros hatással vannak az emberi szervezet szerveire és szöveteire. Az antitestek képesek kötődni ezekhez a károsító anyagokhoz és blokkolni őket, pl. semlegesíteni. A diagnosztikus semlegesítési reakció az antitestek ezen tulajdonságán alapul. Ezt úgy hajtják végre, hogy állatokba vagy érzékeny vizsgálati tárgyakba (sejtkultúra, embriók) antigén-antitest keveréket juttatnak. Például a toxinok kimutatására a páciens anyagában az 1. csoportba tartozó állatokat a páciensből származó anyaggal injektálják. A 2. csoportba tartozó állatokat hasonló anyaggal injekciózzuk, és előkezeljük a megfelelő antiszérummal. Az 1. csoportba tartozó állatok elpusztulnak, ha méreganyag van az anyagban. Az állatok második csoportja túléli a toxin károsító hatásait, mivel semlegesítik.

13.6. Jelzett antitesteket vagy antigéneket használó reakciók

13.6.1. Immunfluoreszcens reakció (RIF, Koons-módszer)

Ezt a módszert expressz diagnosztikára használják. Mikrobás antigének és antitestek kimutatására egyaránt használható.

Közvetlen RIF módszer- az antitestek antigénekkel való kölcsönhatásának immunreakciója, és az antitestek fluorokrómmal vannak jelölve - olyan anyag, amely bizonyos hullámhosszúságú fénykvantumokat képes kibocsátani, ha egy bizonyos hullámhosszú fénynek van kitéve. Ennek a módszernek az a sajátossága, hogy el kell távolítani az el nem reagált komponenseket, hogy kizárjuk a nem specifikus lumineszcencia kimutatását. Ehhez mossa le a nem reagált antitesteket. Az eredményeket fluoreszcens mikroszkóppal értékeljük. Az ilyen lumineszcens szérummal kezelt kenetben lévő baktériumok sötét háttér előtt világítanak a sejt peremén.

Indirekt RIF módszer gyakrabban használják, mint az előzőt. Ezt a reakciót két lépésben hajtják végre. Az első szakaszban az antigének kölcsönhatásba lépnek

kölcsönhatásba lépnek a megfelelő antitestekkel, immunkomplexeket képezve. Minden olyan komponenst, amely nem reagált (azaz nem része az immunkomplexeknek), mosással el kell távolítani. A második szakaszban a kapott antigén-antitest komplexet fluorokrómozott antiglobulin szérum segítségével mutatják ki. Ennek eredményeként mikroba + antimikrobiális nyúl antitestek + nyúl immunglobulinok elleni antitestek komplexe képződik, amelyet fluorokrómmal jelöltek. Az eredményeket fluoreszcens mikroszkóp segítségével értékeljük.

13.6.2. Enzim immunszorbens módszer vagy vizsgálat

ELISA - a leggyakoribb modern módszer, vírusos, bakteriális, protozoonfertőzések diagnosztizálására használják, különösen HIV-fertőzés, vírusos hepatitis stb.

Nagyon sok ELISA-módosítás létezik. A szilárd fázisú, nem kompetitív ELISA-t széles körben használják. 96 lyukú polisztirol lemezeken (szilárd fázis) hajtják végre. A reakció végrehajtásakor minden szakaszban le kell mosni az el nem reagált komponenseket. Az antitestek meghatározásakor a vizsgált vérszérumot hozzáadják az antigéneket felszívódó üregekhez, majd enzimmel jelölt antiglobulin szérumot. A reakciót az enzim szubsztrátjának hozzáadásával hajtjuk végre. Enzim jelenlétében a szubsztrát megváltozik, az enzim-szubsztrát komplexet úgy választják ki, hogy a reakcióban keletkező termék elszíneződjön. Így pozitív reakció esetén az oldat színének megváltozása figyelhető meg. Az antigének meghatározásához a szilárd fázisú hordozót antitestekkel szenzitizálják, majd a tesztanyagot (antigéneket) és az enzimmel jelölt szérumot egymás után hozzáadják az antigénekhez. A reakció végbemeneteléhez az enzim szubsztrátját adják hozzá. Pozitív reakció esetén az oldat színe megváltozik.

13.6.3. Immunblot vizsgálat

Ez a módszer az elektroforézis és az ELISA kombinációján alapul. Az immunoblot elvégzésekor (blot angol nyelvből. folt- folt) antigének komplex keverékét először poliakrilamid gélben elektroforézisnek vetjük alá. A kapott frakcionált anti-

génpeptidek nitrocellulóz membránra kerülnek. A blotokat ezután egy specifikus antigén elleni enzimmel jelölt antitestekkel kezelik, pl. végezzen ELISA blotot. Az immunoblot-vizsgálatot olyan fertőzések diagnosztizálására használják, mint a HIV.

13.6.4. Immun elektronmikroszkópia

A módszer magában foglalja a vírusok (ritkábban más mikrobák) elektronmikroszkóppal történő mikroszkópos vizsgálatát, amelyeket a megfelelő immunszérummal előkezelnek, amelyet elektronoptikailag sűrű preparátumokkal, például ferritinnel, egy vastartalmú fehérjével jelöltek.

13.7. Áramlási citometria

A vérsejteket a lézeres citofluorometria alapján differenciálják. Ehhez a kívánt sejteket CD-antigénekkel szembeni fluoreszcens monoklonális antitestekkel festik meg. A vérmintát, miután jelölt antitestekkel kezelték, egy vékony csövön vezetik át, és lézersugarat vezetnek át rajta, ami a fluorokrómot izzásba gerjeszti. A fluoreszcencia intenzitása korrelál a sejtfelszínen lévő antigének sűrűségével, és kvantitatívan mérhető fotosokszorozó cső segítségével. A kapott eredményeket hisztogrammá alakítjuk.

Az áramlási citometriát az immunállapot (a limfociták fő populációinak tartalma, intracelluláris és extracelluláris citokinek tartalma, NK-sejtek funkcionális aktivitása, fagocitózis aktivitása stb.) meghatározására használják.