Hemagglutinációs reakció (HRA)

Az RGA azon a tényen alapul, hogy bizonyos típusú baktériumok és vírusok képesek adszorbeálódni a vörösvértestek felületén. különböző típusokállatok (és madarak), összetapadnak és agglutinátumot képeznek (közvetlen RGA).

Az antigén (baktériumok, vírusok) adszorpciója a vörösvértestek felszínén nem mindig nyilvánul meg látható csapadék képződésében; Ezenkívül az RHA nem specifikus, mivel ugyanazon állatfaj vörösvérsejtjei különböző antigéneket képesek adszorbeálni.

A passzív (indirekt) hemagglutinációs reakció (RPHA) specifikus. Ennek az eljárásnak a végrehajtásához először egy eritrocita diagnosztikát (eritrocitákat, amelyeken az antigén adszorbeálódik) készítenek. Ebből a célból birka- (vagy kakas-)vért sterilen veszünk, defibrináljuk és foszfáttal pufferolt oldatban (pH 7,2) többször mossuk 3-5-szörös centrifugálással. A felülúszót eltávolítjuk, az eritrociták koncentrációját 2,5%-ra (1:40) állítjuk be. Egy 2,5%-os vörösvértest-szuszpenzióhoz adjunk azonos térfogatú (1 ml vagy 0,5 ml) a vizsgált mikrobafajok baktériumainak szuszpenzióját 5-10 milliárd sejt/1 ml koncentrációban. A vörösvérsejtek könnyen adszorbeálják a poliszacharid antigéneket. A fehérje antigén adszorbeálásához a vörösvértesteket 1:20 000 hígítású tanninnal előkezeljük. A vörösvértesteket a hozzáadott antigénnel kombinálva 2 órán át termosztátban (37 °C) hagyjuk érzékenyíteni (adszorpcióra), majd centrifugáljuk. ismét 3-4 ezer ford./perc sebességgel 5 percig foszfát pufferoldattal (9.13. ábra).

Az így kapott eritrocitadiagnosztikát kémcsövekbe (vagy plexi tábla mélyedéseibe) helyezzük, és standard immunszérumot adunk hozzá.

Pozitív esetekben RHA fordul elő – vörösvértestek elvesztése jellegzetes pelyhes vagy szemcsés üledék formájában, amely a kémcső aljának teljes felületén eloszlik (hemagglutinát). Ez azt jelenti, hogy a vizsgált mikroba típusa (antigén) specifikus az immunszérum antitesteire. Negatív esetekben a nem ragasztott vörösvértestek egy kis, egyenletes kör alakjában leülepednek az aljára.

Az eredmények nagyobb megbízhatósága érdekében RPGA-t hajtanak végre reakció késleltetése(fékezés) hemagglutinációs jelenség(RZGA) vagy annak módosítása - antitest semlegesítési reakció(RIA).

Rizs. 9.13. Passzív hemagglutinációs reakció (séma): Er - vörösvérsejtek: AG - antigén: AT - antitest

Az RZGA lényege abból áll, hogy agglutinációs reakciót hajtanak végre egy specifikus diagnosztikai szérummal és egy tesztantigénnel (antigénként a vizsgált mikroba típusát használják). Ezt a keveréket 1-2 órán át 37 °C-on tartjuk, majd hozzáadjuk a vörösvértesteket. Ha a teszt antigén homológ a diagnosztikai szérum antitesteivel, akkor azok kölcsönhatásba lépnek egymással, és a hozzáadott vörösvértestek nem agglutinálódnak - a reakció eredménye pozitív. Ha a tesztantigén nem homológ a szérum antitestekkel, vagy az anyag nem tartalmazza, akkor a hozzáadott eritrociták adszorbeálják az antigént és RGA keletkezik - az RGA eredmény negatív, a vizsgált mikroba (antigén) típusa nem állapítható meg.

A PH A beállításának módszertana az, hogy befogadják egyenlő térfogatokés keverje össze a diagnosztikai immunszérumot a vizsgált anyag különböző hígításaival (a kívánt antigénnel), hagyja érintkezni 1-2 órán keresztül, majd adjon hozzá egy bizonyos (ismert) szérumantitestekre specifikus antigénnel szenzitizált vörösvértesteket (eritrocita diagnosztizálás). . Amikor a kívánt antigén reakcióba lép a szérum antitestekkel, azok semlegesítődnek, és a hozzáadott vörösvértestek nem agglutinálódnak, RHA nem lép fel - az RHA eredmény pozitív. Ha a vizsgálati anyag nem tartalmaz a felhasznált szérum antitesteire specifikus antigént, az antitestek semlegesítése nem történik meg. Ezért az eritrocitadiagnosztika hozzáadásakor az eritrociták agglutinációja (hemagglutináció) jelenik meg, és az RNS eredmény negatív. Az antitest-semlegesítési reakció rendkívül érzékeny módszer az antigén kimutatására nem csak élő (vagy elpusztult) baktériumok szuszpenziójában, hanem különböző szervek őrölt szöveteinek szuszpenziójában, natív és felmelegített váladékában, valamint beteg szervezet ürülékében is.

1. Hemagglutinációs reakció

(RGA)

vírusok kimutatására és azonosítására szolgáló módszer, amely egyes vírusok azon képességén alapul, hogy szelektíven agglutinálja bizonyos állatfajok vörösvérsejtjeit.

Az RGA a vörösvértest-adhézió jelenségén alapul, amely különféle tényezők hatására lép fel. Közvetlen és közvetett hemagglutináció létezik. A közvetlen hemagglutinációs reakcióban a vörösvérsejtek összetapadnak, amikor bizonyos antigének, például vírusok adszorbeálódnak rájuk.

BAN BEN szerológiai vizsgálatok Közvetlen hemagglutinációs gátlási reakciót alkalmaznak, amikor a betegből izolált vírust specifikus immunszérummal semlegesítik, majd vörösvértestekkel kombinálják. A hemagglutináció hiánya a vírus és az alkalmazott immunszérum konzisztenciáját jelzi.

Reakció indirekt hemagglutináció(passzív hemagglutináció) olyan esetekben figyelhető meg, amikor immunszérumot vagy megfelelő antitesteket tartalmazó betegszérumot adnak a különböző antigénekkel korábban kezelt (szenzitizált) vörösvértestekhez. Megtörténik a vörösvértestek specifikus ragasztása, passzív hemagglutinációjuk.

Az indirekt vagy passzív hemagglutinációs reakció érzékenysége és specifitása jobb, mint más szerológiai módszerek, és baktériumok, rickettsia és protozoa által okozott fertőzések diagnosztizálására használják.

A közvetett hemagglutinációs reakció végrehajtásának módszere több szakaszból áll. Először a vörösvértesteket izotóniás nátrium-klorid-oldattal mossuk, majd szükség esetén (fehérje antigének használatakor) 1:20 000 tannin-oldattal kezeljük, és oldható antigénekkel érzékenyítjük. Pufferolt izotóniás nátrium-klorid oldattal végzett mosás után az eritrocita antigén használatra kész. A vizsgálati szérumokat izotóniás nátrium-klorid-oldattal hígítjuk kémcsövekben vagy speciális, mélyedésekkel ellátott műanyag lemezeken, majd a szérum minden hígításához vörösvértest-diagnosztikát adunk. Az indirekt hemagglutinációs reakció eredményeit a kémcső alján képződött vörösvérsejt üledék jellege veszi figyelembe. Az a reakció eredménye, amelyben a vörösvérsejtek egyenletesen lefedik a cső teljes alját, pozitívnak minősül. Nál nél negatív reakció A vörösvértestek kis korong vagy „gomb” formájában a kémcső aljának közepén helyezkednek el.

RGA használata

Az RGA-t vírusok kimutatására (detektálására) használják az előzetes diagnosztika során, a vírusok hemagglutináló tulajdonságok szerinti titrálására (hemagglutináló egységek létrehozása - AE).

Vírus adszorpciója

A vírusok által kiváltott agglutinációs jelenség alapja a vírusok adszorpciója a vörösvértestek felszínén, ez utóbbiak összeragasztásával (agglutinációjával) és kicsapódásával jár együtt.

Antigén az RGA-hoz

Minden olyan anyagot (szervekből származó szuszpenzió formájában lévő kóros anyagot, fertőzött EK-ból származó anyagot, szövettenyészetet stb.), amelyben vírus jelenlétére gyanakodnak, RGA antigénnek kell tekinteni. Az anyagnak folyékonynak kell lennie, nagy részecskék nélkül.

Hozzávetőleges RGA beállítása

A hozzávetőleges RGA beállításához egy csepp vírustartalmú anyagot csepegtetünk egy tiszta és jól zsírtalanított tárgylemezre, egy csepp 5%-os vörösvértest-szuszpenziót adunk hozzá, és üvegrúddal összekeverjük.

Az RGA reakciójának értékelése

A reakciót keresztekkel (pluszokkal) értékeljük. A keresztezési reakció értékelésekor ügyeljen az üledék természetére. Ha a vörösvértestek vékony rétegben egyenletesen megtelepednek a kémcső alján (esernyő formájában), akkor a reakció négy keresztezéssel értékelődik.

2. Hemagglutináció-gátló reakció- szerológiai reakció, amely az antitestek azon képességén alapul, hogy megakadályozzák az eritrociták agglutinációját hemagglutináló típusú vírusok (adenovírusok, arbovírusok, egyes enterovírusok, influenza és parainfluenza vírusok, kanyaró, reovírusok) által. A specifikus antivirális antitestek kölcsönhatásba lépnek e vírusok virionjainak felszíni hemagglutinin molekuláival, és blokkolják azok kötődését az eritrocita membrán komplementer molekuláihoz.

A közelmúltban a reakciót széles körben alkalmazzák a klinikai virológiai laboratóriumokban bizonyos vírusok elleni specifikus antitestek titereinek meghatározására, valamint a betegek klinikai anyagából származó vírusizolátumok szerológiai azonosítására és tipizálására. Alkalmazásuk némileg korlátozott, mivel az emberi vérszérumban nem specifikus vírusinhibitorok, valamint természetes antitestek - agglutininek - vannak jelen.

Hemagglutinációs gátlási reakció (HAI). Neve ellenére a reakció elve sok tekintetben hasonlít a vírusok pH-jához, mivel az AT azon képességén alapul, hogy különféle vírusokat megköt és semlegesít, így lehetetlenné teszi a vörösvértestek agglutinációját. Vizuálisan ez a hatás a hemagglutináció „gátlásában” nyilvánul meg. Az RTGA-t a vírusfertőzések diagnosztizálására használják specifikus antihemagglutininek azonosítására, és különböző vírusok azonosítására hemagglutininjeik alapján, amelyek az Ag tulajdonságait mutatják.

Hemagglutináció-gátló reakció

(RTGA)

vírus azonosítására vagy vírusellenes antitestek kimutatására szolgáló módszer a páciens vérszérumában, amely azon a jelenségen alapul, hogy a vörösvértestek nem agglutinálódnak vírust tartalmazó gyógyszerrel szemben immunis vérszérum jelenlétében.

Hemagglutináció-gátló reakció. Mechanizmus és gyakorlati felhasználás.

Számos vírus képes agglutinálni a szigorúan meghatározott emlős- és madárfajok vörösvérsejtjeit. Így az influenza- és mumpszvírusok csirkék, tengerimalacok és emberek vörösvértesteit, az adenovírusok pedig patkányok és egerek vörösvértesteit agglutinálják. E tekintetben kimutatni ezeket a betegek anyagában vagy sejttenyészetekben, embriókban és állatokban, hemagglutinációs reakció(RGA). Ehhez készítsen kétszer növekvő hígítást a vírustartalmú anyagokból és folyadékokból a lemezek üregeiben, és adjon hozzájuk izotóniás oldattal mosott szuszpenziót. A vörösvérsejtek NaCl-ja. A spontán agglutináció szabályozására a vörösvérsejteket azonos térfogatú izotóniás NaCl-oldattal keverik össze. A keverékeket termosztátban 37 °C-on vagy szobahőmérsékleten inkubáljuk.

A röntgenanalízis eredményeit az eritrocita agglutináció jellege 30-60 perc után veszi figyelembe, amikor a kontrollban általában teljesen kicsapódnak. A pozitív reakciót pluszjelek jelzik. „++++” – „esernyő” formájú üledék, „+++” – lumenekkel rendelkező üledék, „++” – nagy lumenekkel rendelkező üledék, „+” – pelyhes üledék, amelyet összegyűrt eritrociták zónája vesz körül , és „–” – ugyanaz az élesen meghatározott vörösvértest-üledék „gomb” formájában, mint a kontrollban

Mivel csoportspecifikus, az RGA nem teszi lehetővé a vírusfajták meghatározását. segítségével azonosítják őket hemagglutináció gátló reakciók(RTGA). Felállításához jól ismert immun vírusellenes szérumokat használnak, amelyeket kétszeresére csökkenő koncentrációban izotóniás nátrium-klorid oldatban hígítanak, és a lyukakba öntik. Minden hígításhoz azonos mennyiségű vírust tartalmazó folyadékot adunk. A kontroll a vírus szuszpenziója izotóniás nátrium-klorid oldatban. A szérum és vírus keverékét tartalmazó lemezeket 30 percig termosztátban vagy 2 órán keresztül szobahőmérsékleten tartjuk, majd mindegyikhez vörösvértest-szuszpenziót adunk. 30 perc elteltével meghatározzuk a vírussemlegesítő szérum titerét (azaz maximális hígítását), amely késleltette az eritrocita agglutinációt.

Az RTGA-t vírusos betegségek szerológiai diagnosztizálására használják, különösen az influenza és adeno vírusos fertőzések. Jobb az RN-hez hasonlóan használni, páros szérumokkal. Az antitesttiter négyszeres növekedése a második szérumban megerősíti a feltételezett diagnózist

3. Szerológiai vizsgálat lehetővé teszi a diagnózis felállítását, ha specifikus antitesteket észlelnek a betegek szérumában. A szerológiai reakciókhoz párosított szérumokat használnak, amelyeket a betegség kezdetétől számított első napokban és 1-3 hét elteltével vesznek, de egyidejűleg tanulmányozzák. Az antitesttiter 4-szeres vagy nagyobb növekedése diagnosztikus jelentőségű. Az RTGA, RN, RSK, RTGads, RIF, RIA, ELISA a megfelelő vírusok referencia törzseiből előállított antigénekkel (diagnosztikai anyagokkal) használható.

4. Páros - ez azt jelenti, hogy a vért kétszer veszik, bizonyos időközönként. Az antitesttiter növelésével megállapítható, hogy fertőzés történt. Ha az antitesttiter nem változik, az azt jelenti, hogy ezek az antitestek már régóta a szervezetben vannak, nincs friss fertőzés.

A legnagyobb diagnosztikai érték az állatokból a betegség kezdetén és végén (14-21 napos időközönként) vett páros szérumok vizsgálata. A szérumot steril kémcsövekbe gyűjtjük, és tesztelés céljából tároljuk.

Leírás

A sertés parvovírus betegség diagnosztikai készletét a szuszpenzióban lévő parvovírus antigén kimutatására tervezték belső szervek abortált magzatok a hemagglutinációs reakcióban (HRA) és specifikus antitestek a sertések vérszérumában, valamint újszülött malacok (a kolosztrum beadása előtt) a hemagglutinációs gátló reakcióban (HIA). A reakciót mikromódszerrel polisztirol lemezek üregeiben hajtjuk végre. 96 lyukú polisztirol lemezek immunológiai reakciókhoz; specifikus inaktivált antigén, legalább 1:128 hemagglutináló aktivitással; specifikus szérum, amelynek aktivitása RTGA-ban legalább 1:256; szérum normál (negatív kontroll).

Elemzés ideje:

RGA - 2,5-3,5 óra, RTGA - 3,5-4,5 óra (nem figyelembe véve a tanulmányi anyagok elkészítésének idejét).

A módszer elve:

A hemagglutinációs reakció (HRA) a vírus hemagglutináló tulajdonságainak hatására folyadékban szuszpendált vörösvértestek ragasztásán és esernyő formájú laza üledék képződésén alapul. Az RTHA lényege, hogy a vérszérumban található specifikus antitestekkel semlegesítse a vírus hemagglutináló tulajdonságait, aminek eredményeként a vörösvértestek nem tapadnak össze, és leülepednek a fenékre, sűrű üledéket képezve a vérszérumban. gomb.

Tárolási feltételek

A készletet száraz helyen, fénytől védve, 2-8°C hőmérsékleten kell tárolni. Feloldódás után a készlet komponensei 1 hónapig fagyasztva tárolhatók. Az újrafagyasztás nem megengedett.

Legjobb előtti dátum

A vörösvértestek (vagy latex részecskék) a rajtuk adszorbeált antigénekkel kölcsönhatásba lépnek a vérszérumban lévő megfelelő antitestekkel, aminek következtében a vörösvértestek összetapadnak, és a kémcső vagy sejt aljára hullanak ki csipkés formájában. üledék. Negatív reakció esetén a vörösvértestek gomb formájában telepednek le. Agglutinációs reakció mikrováltozatban egy 96 lyukú lemez sejtjeiben végezhető immunológiai vizsgálatokhoz kúpos aljú. Adjunk hozzá 0,05 ml PBS-t (pH 7,2-7,4) a lemez üregeibe, és készítsünk kettős hígítást a vizsgált vérszérumból 1:2 vagy magasabb arányban. Ezután minden sejthez 0,005 ml gombasejtek szuszpenzióját adjuk 100 ezer gombasejt/1 ml koncentrációban. A tablettát óvatosan felrázzuk és termosztátban tartjuk 37°C-on 2 órán át, majd 4°C-on 16-18 órán át. Negatív kontrollként normál (negatív) vérszérumot és PBS-t használunk. A reakció eredményeit mikroszkóppal és vizuálisan is figyelembe veszik, és keresztben határozzák meg a következő séma szerint: (++++) - a folyadék teljes kiürítése és az agglutinátum képződése a kút alján fordított „esernyő” formájában, amikor megrázzuk, az „esernyő” pelyhekre törik; (+++) - a folyadék hiányos kiürítése és egy jól meghatározott „esernyő”; (++) - a folyadék észrevehető kitisztulása, az „esernyő” mérsékelten kifejezett; (+) - a folyadék alig észrevehető kitisztulása, az „esernyő” gyengén kifejeződik; (-) - negatív eredmény, a folyadék nem tisztult ki, a kút alján gomb formájában üledék van, enyhe rázással egyenletes szuszpenzió képződik. A tesztszérum utolsó hígítását, amelyben legalább két keresztezés agglutinációja történt (++), vettük antitesttiternek.

hemagglutinációs gátlási reakció (HAI)

Az RHA a vörösvérsejtek azon képességén alapul, hogy összetapadnak, amikor bizonyos antigének adszorbeálódnak rajtuk. A hemagglutináció vizsgálatához allantois- és magzatvizet, csirkeembriók chorioallantois membránjának szuszpenzióját, vírusokkal fertőzött állatok tenyészeteiből vagy szerveiből származó szuszpenziókat és kivonatokat, valamint natív fertőző anyagot használnak. Az RGA nem szerológiai jellegű, mivel immunszérum részvétele nélkül fordul elő, és az antigén munkahígításának kiválasztására szolgál az RGA végrehajtásához, vagy egy antigén (vírus) jelenlétét a vizsgálati anyagban (például influenza esetén). A reakció során állatok, madarak és emberek I. vércsoportjába tartozó vörösvértesteket használnak (0).

A hozzávetőleges RGA beállításához egy csepp 5%-os vörösvértest-szuszpenziót és egy csepp vizsgálati anyagot helyezünk egy tárgylemezre, és alaposan összekeverjük. Nál nél pozitív eredmény 1-2 perc elteltével makroszkóposan megfigyelhető az eritrociták pelyhes agglutinációjának megjelenése.

A polisztirol lemezek üregeiben az RGA széthajtott sorban történő felállításához a vizsgált anyagból kétszeresen növekvő hígításokat készítünk fiziológiás oldatban 0,5 ml térfogatban. Minden kémcsőbe 0,5 ml 0,25-1%-os vörösvértest-szuszpenziót adunk. Az eredményeket a kontroll (vörösvértestek + sóoldat) vörösvértestek teljes ülepedése után vesszük figyelembe. A reakciót az eritrocita üledék természete veszi figyelembe. Pozitív esetekben az agglutináció mértékét pluszjelekkel jelöljük. A kémcső (ernyő) alját lefedő, ragacsos vörösvértestek vékony filmjeként megjelenő reakciót négy pluszjellel értékeljük, ha a filmben hézagok vannak, a csipkés film jelenléte A ragacsos vörösvértestek élei két pluszjellel vannak jelölve, a vörösvértestek pelyhes üledéke, amelyet vörösvértestek agglutinált csomóinak zónája vesz körül, egy plusznak felel meg. A kontrolltól megkülönböztethetetlen, élesen meghatározott eritrocita üledék az agglutináció hiányát jelzi. A titert a vizsgálati anyag azon maximális hígításának tekintjük, amely az eritrociták két plusz agglutinációját okozta.

Ha az RHA eredmény pozitív, a vizsgálatot folytatják, meghatározva az izolált vírus típusát típusspecifikus szérummal végzett hemagglutinációs gátlási reakcióval.

Az RTGA az antiszérum azon tulajdonságán alapul, hogy elnyomja a vírus hemagglutinációját, mivel a specifikus antitestek által semlegesített vírus elveszíti a vörösvérsejtek agglutinációjának képességét. A vírusok kísérleti tipizálásához az üvegen végzett csepp módszert alkalmazzák. Az izolált vírus típusának végleges megállapításához és a szérumban lévő antitestek titrálásához egy kiterjesztett RTGA-t helyezünk kémcsövekbe vagy lyukakba. Ebből a célból fiziológiás oldatban kétszeres hígítású szérumot készítünk, és 0,25 ml-re adagoljuk. A szérumhígításokhoz adjunk egy csepp vírust tartalmazó anyagot és egy csepp 1%-os vörösvérsejt-szuszpenziót.

Amikor RTGA-t használunk a vírus típusának meghatározására, típusspecifikus szérumokat használunk, amelyeket az antigén munkahígításának azonos térfogatához adunk. Az izolált vírus típusát az a specifikus immunszérum határozza meg, amely a vírus elleni antitestek legmagasabb titerét mutatta.

Az RGA-t és az RTGA-t széles körben használják vírusfertőzések diagnosztizálására ( kullancs által terjesztett agyvelőgyulladás, influenza stb.) specifikus antitestek kimutatása és számos vírus azonosítása antigénjeik alapján.

Immunfluoreszcens reakció (RIF)

A RIF baktériumok, rickettsia és vírusok antigénjeinek és fluoreszcens festékekkel jelölt specifikus antitestekkel (fluoreszcein-izotiocianát, rodamin, B-izoticianát, lisszatin-rodamin B-200, szulfoklorid stb.) kombinációján alapul, amelyek reaktív csoportokkal (szulfoklorid-ciánnal) rendelkeznek. stb.) . Ezek a csoportok az antitestmolekulák szabad aminocsoportjaival egyesülnek, amelyek nem veszítik el specifikus affinitásukat a megfelelő antigénhez, ha fluorokrómmal kezelik. A keletkező AG–AT komplexek fluoreszcens mikroszkóp alatt jól látható, erősen világító szerkezetekké válnak (48. ábra). A RIF képes kimutatni kis mennyiségű bakteriális és vírusantigént. A RIF módszer két változatban használatos: direkt és indirekt módszerrel.

A közvetlen módszer egy antigén és egy jelölt antitest közvetlen kombinációján alapul. Az indirekt módszer az AG–AT komplex fluoreszcens festékek segítségével történő lépésről lépésre történő kimutatásán alapul. Az első szakasz egy specifikus antigén immunkomplexeinek kialakulása specifikus antitestekkel. A második lépés ennek a komplexnek az azonosítása jelzett antigammaglobulinnal történő kezeléssel.

A RIF előnye az egyszerűség, a nagy érzékenység és az eredmények elérésének gyorsasága. A RIF-et influenza, vérhas, malária, pestis, tularémia, szifilisz stb. korai expressz diagnosztizálására használják. Fluoreszcens mikroszkópot használnak az ilyen vizsgálatok elvégzésére.

Radioimmunoassay (RIA)

A RIA az egyik legérzékenyebb immundiagnosztikai módszer. A hepatitis B vírus antigén kimutatására szolgál vírusos hepatitisben szenvedő betegeknél. Ehhez referenciaszérumot (a hepatitis B vírus elleni antitesteket tartalmazó szérumot) adnak a vizsgált szérumhoz. A keveréket 1-2 napig 40 0 ​​C-on inkubáljuk, majd referencia antigént (125 J izotóppal jelölt antigént) adunk hozzá, és az inkubálást további 24 órán át folytatjuk. A referencia szérumfehérjék ellen kicsapó antiimmunglobulinokat adnak a kapott antigén-antitest komplexhez, ami csapadék képződéséhez vezet (49. ábra). Az eredményt a számláló által rögzített csapadékban lévő impulzusok jelenléte és száma veszi figyelembe. Ha van a tesztszérumban olyan antigén, amely specifikus antitestekhez kötődött, az utóbbiak nem lépnek kölcsönhatásba a jelölt antigénnel, és ezért nem mutatható ki a csapadékban. Így a RIA a kimutatott antigén és ismert mennyiségű jelölt antigén és az antitestek aktív központjai közötti kompetitív kölcsönhatás elvén alapul.

Enzimhez kötött immunszorbens módszer (ELISA)

A módszert antigének kimutatására használják a megfelelő antitestek felhasználásával, amelyek egy tag enzimhez (torma-peroxidáz, b-galaktóz vagy alkalikus foszfatáz) konjugáltak. Miután az antigént az enzimmel jelölt immunszérummal kombináltuk, egy szubsztrátot és kromogént adunk a keverékhez. . A szubsztrátot az enzim hasítja, és bomlástermékei a kromogén kémiai módosulását okozzák. Ugyanakkor a kromogén megváltoztatja a színét – a szín intenzitása egyenesen arányos a megkötött antigén- és antitestmolekulák számával (50. ábra).

A leggyakoribb szilárd fázisú ELISA, amelyben az egyik komponens immunreakció(antigén vagy antitest) szilárd hordozón szorbeálódik. A polisztirol mikropaneleket szilárd hordozóként használják. Az antitestek meghatározásakor a páciens vérszérumát, az enzimmel jelölt antiglobulin szérumot, valamint az enzim- és kromogénszubsztrát oldatok keverékét egymás után hozzáadják a szorbeált antigént tartalmazó üregekhez. Minden alkalommal, amikor újabb komponenst adunk hozzá, a meg nem kötött reagenseket alapos mosással távolítjuk el a lyukakból. Ha az eredmény pozitív, a kromogén oldat színe megváltozik.

A szilárd fázisú hordozó nemcsak antigénnel, hanem antitesttel is érzékenyíthető. Ezután a kívánt antigént hozzáadjuk a szorbeált antitestekkel ellátott üregekbe, az enzimmel jelölt antigén elleni immunszérumot, majd az enzim és a kromogén szubsztrát oldatainak keverékét.

Az ELISA-t vírusos és bakteriális kórokozók által okozott betegségek diagnosztizálására használják.

SZAKASZ VII. A VIRUSOLÓGIA ALAPJAI

Vidal reakció. A betegség második hetétől a fertőző ágens elleni antitestek felhalmozódnak a betegek vérében. Azonosításukra a beteg vérszérumát agglutinációs reakcióban vizsgálják. Az elölt Salmonella tenyészeteket - diagnosztikai anyagokat - használják antigénként.

A Widal-reakció végrehajtásához a páciens szérumát, diagnosztikai készleteket és izotóniás nátrium-klorid oldatot használnak.

Az ujj pulpájából vagy a cubitalis vénából származó vért (2-3 ml) steril csőbe gyűjtjük és a laboratóriumba szállítjuk. A laboratóriumban a kémcsövet termosztátba helyezzük 20-30 percre, hogy alvadék alakuljon ki, majd Pasteur pipettával körbeírjuk a vérrögöt, hogy elválasszuk a kémcső falától, és hidegbe helyezzük. 30-40 percig. A leválasztott szérumot leszívják, és Salmonella typhus és paratífusz láz diagnosztikájával agglutinációs reakció végrehajtására használják. A vér centrifugálható a szérum előállításához.

Fertőző folyamat – tífusz vagy paratífusz – bekövetkezésekor a szervezet O- és H-antitesteket termel a kórokozó ugyanazon antigénjei ellen.

Az O-antitestek először jelennek meg, és elég gyorsan eltűnnek. A H-antitestek sokáig fennmaradnak. Ugyanez történik az oltás során is, ezért az O- és H-antigénnel pozitív Widal-reakció a betegség jelenlétét jelzi, és csak a H-antigénekkel történő reakció léphet fel mind a betegségből felépülteknél (anamnesztikus reakció), mind a betegségből. beoltottak (vakcina reakció). Ennek alapján a Widal-reakciót O- és H-antigénekkel (diagnosztikumok) külön hajtják végre.

Mivel a tífusz és a paratífusz A és B klinikailag hasonlóak, a betegség természetének azonosítása érdekében a beteg szérumát a Salmonella typhus és a paratífusz A és B diagnosztikájával egyidejűleg vizsgálják.

A Widal-reakciót széles körben használják, mivel egyszerű és nem igényel különleges feltételeket.

A reakció kétféleképpen hajtható végre: cseppenkénti és térfogati úton (lásd a 12. fejezetet). A gyakorlatban a volumetrikus módszert gyakrabban használják. Lineáris agglutinációs reakció végrehajtásakor a sorok számának meg kell egyeznie az antigének számával (diagnosztikumok). A betegség kórokozója egy mikroorganizmus, amelyből a diagnosztikát a beteg széruma agglutinálta. Néha csoportos agglutináció figyelhető meg, mivel a tífusz és a paratífusz kórokozói gyakoriak. csoportos antigének. Ebben az esetben a reakció eredménye abban a sorozatban, amelyben a szérum nagyobb hígításában agglutinációt észleltek, pozitívnak tekinthető (36. táblázat).

36. táblázat Az agglutinációs reakció lehetséges eredménye

Jegyzet. A gyakorlatban a Widal-reakciót négy diagnosztikai módszerrel hajtják végre: „O” és „H” tífusz, valamint „ON” diagnosztikai diagnosztikai eszközökkel az A és B paratífusz.

Ha az agglutináció csak kis szérumhígításokban fordul elő - 1:100, 1:200, akkor a betegség alatti reakció és a vakcinázási vagy anamnesztikus reakció megkülönböztetése érdekében az agglutinációs reakciót 5-7 nap elteltével megismétlik. Egy betegnél az antitesttiter megemelkedik, de beoltott vagy felépült embernél nem változik. Így a vérszérum antitest-titerének növekedése a betegség indikátoraként szolgál.

A Vi antigént tartalmazó tífusz kórokozók szervezetbe való bejutására válaszul a beteg vérében Vi agglutininek jelennek meg. A betegség 2. hetétől észlelhetők, de titerük általában nem haladja meg az 1:10-et. A Vi-antitestek kimutatása összefügg a tífusz kórokozók szervezetben való jelenlétével, ezért ezen antitestek meghatározása nagy epidemiológiai jelentőséggel bír, mivel lehetővé teszi a baktériumhordozók azonosítását.

Vi-hemagglutinációs reakció. Ez a legérzékenyebb reakció az antitestek kimutatására.

A reakció elve az, hogy az emberi (I. csoport) vagy birka vörösvértestek speciális kezelés után képesek adszorbeálni a Vi-antigént a felületükön, és ezáltal a megfelelő Vi-antitestekkel agglutinálódni képesek.

A felszínen adszorbeált antigénekkel rendelkező vörösvértesteket vörösvértest-diagnosztikának nevezzük.

A Vi-hemagglutinációs reakció végrehajtásához tegye a következőket:

1) a beteg vérszéruma (1-2 ml); 2) eritrocita Salmonella Vi-diagnosticum; H) Vi-szérum; 4) O-szérum; 5) izotóniás nátrium-klorid oldat.

A reakciót agglutinációs csövekben vagy lyukakkal ellátott műanyag lemezeken hajtjuk végre.

A pácienstől ugyanúgy vesznek vért, mint a Vidal-reakciónál. Szérumot kapunk. A szérumból kétszeres sorozathígításokat készítenek, 1:10-től 1:160-ig.

Mindegyik hígításból 0,5 ml-t adunk az üregbe, és 0,25 ml eritrocitadiagnosztikát. A reakciót 0,75 ml térfogatban hajtjuk végre.

A kontrollok a következők: 1) standard agglutináló monoreceptor szérum + diagnosztikum - a reakciónak pozitívnak kell lennie a szérumtiterig; 2) diagnosticum izotóniás nátrium-klorid oldatban (kontroll) - a reakciónak negatívnak kell lennie.

A lyukak tartalmát alaposan összekeverjük, 2 órára termosztátba helyezzük és másnapig (18-24 óráig) szobahőmérsékleten hagyjuk.

A könyvelés az ellenőrzéssel kezdődik. A reakciót a diagnosztikum agglutinációjának mértékétől függően értékeljük.

Az eredményeket a négykeresztes rendszer szerint vesszük figyelembe:

A vörösvérsejtek teljesen agglutináltak - üledék a kút alján „esernyő” formájában;

+++ az „ernyő” kisebb, nem minden vörösvérsejt agglutinálódik;

++ az „ernyő” kicsi, a lyuk alján nem agglutinált vörösvértestek üledéke található;

A reakció negatív; a vörösvértestek nem agglutinálódtak és gomb formájában a kút aljára telepedtek.

Ellenőrző kérdések

1. A betegség melyik szakaszában történik a Vidal-reakció?

2. Milyen összetevőkre van szükség a Widal-reakció végrehajtásához?

3. Milyen diagnosztikával hajtják végre a Vidal-reakciót?

4. Melyik szerológiai reakció a legérzékenyebb a tífuszos paratífusz fertőzések diagnosztizálásában?

5. Milyen diagnosztikát használunk a Vi-hemagglutinációs reakció végrehajtása során?

6. Milyen szérummal határozzuk meg a Vi-antigén jelenlétét a vizsgált tenyészetben?

7. Mi a jelentősége a Vi-fagotípus meghatározásának?

Vegye át a Salmonella typhus, a paratífusz A és a paratífusz B O- és H-diagnosztikáját, valamint a tanártól a páciens szérumát. Adja meg Vidal reakcióját.

Kulturális média

Az EMS, Ploskireva és bizmut-szulfit agar táptalajokat az orvosi ipar állítja elő száraz por formájában. Elkészítésük a címkén található utasítások szerint történik: mérjünk ki egy bizonyos mennyiségű port, öntsük fel a megfelelő mennyiségű vízzel, forraljuk fel és öntsük steril Petri-csészékbe.

Russell szerda. Adjunk hozzá 40 g száraz táptalajt 950 ml desztillált vízhez, és adjunk hozzá 5 g tápagart. Melegítsük, amíg a porok felforrnak és fel nem oldódnak. 1 g x-et feloldunk 50 ml desztillált vízben. óra glükózt és hozzáadjuk az elkészített keverékhez. A táptalajt 5-7 ml-es steril csövekbe öntjük, folyó gőzzel sterilizáljuk (2 napig 2 percig), és leferdítjük, hogy egy oszlop maradjon. A Russell-féle mannitot és szacharózt tartalmazó tápközeget ugyanígy készítjük el.

Olkenitsky táptalaj száraz agarból. 2,5 g száraz tápagart 100 ml desztillált vízben felolvasztunk. A receptben (címke) megadott összes összetevőt hozzáadjuk az 50 °C-ra hűtött agarhoz. A kémcsövekbe öntött táptalajt áramló gőzzel sterilizáljuk (3 napig, egyenként 20 percig), majd lekaszáljuk. Az elkészített tápközegnek halvány rózsaszínűnek kell lennie.

HEMAGLUTINÁCIÓ

hemagglutináció(görög háima vérből és lat. agglutinatio ragasztásból), a vörösvértestek, valamint a hemagglutininek felületén adszorbeálódni képes, baktériumok, vírusok, toxinok stb. hatására vörösvértestek ragasztása, kicsapása. Az egyik állat vörösvérsejtjeit agglutinálhatja egy másik állat széruma, mivel a normál izohemagglutininek (antitestek) vannak benne. A reakció használata G. telepítés . Jelenség G. mikrobiológiai és immunológiai vizsgálatokban használják.

Vannak közvetlen vagy aktív és közvetett vagy passzív, G. Egyenes G. bakteriális és vírusos szerek vörösvértestekre gyakorolt ​​közvetlen hatása okozza. Ebben az esetben a hemagglutininek a mucináz enzim segítségével kölcsönhatásba lépnek az eritrociták felszínén található mukoproteáz receptorokkal, ami az antigén adszorpcióját okozza. Ennek eredményeként a vörösvértestek szuszpenziója (például csirke) széles, esernyő alakú, szaggatott szélű üledéket képez. Ez a reakció nem specifikus, és az immunszérum részvétele nélkül következik be. Közvetlen G. szerológiai vizsgálatokban használják, különösen a gátlási reakcióban használt antigén munkahígításának meghatározásakor G., amely az antigén hemagglutináló hatásának immunspecifikus szérum általi késleltetésén alapul. Közvetlen G. Egyes vírusos betegségek (lóinfluenza, szárnyaspestis, Newcastle-kór, kacsainfluenza) előzetes diagnosztizálására is használják. Közvetett G.(RNGA) a szenzitizált eritrociták azon képességén alapul, hogy a rajtuk lévő antigén adszorpciójával agglutinálódjanak az immunszérum homológ antitesteivel. A közvetett nagy érzékenysége és specifitása miatt G. számos vírusos, bakteriális és rickettsiás betegség diagnosztizálására szolgál. A közvetettnek számos módosítása létezik G. antitestek gátlási, késleltetési, semlegesítési reakciói, stb. Az RNGA és annak módosításai segítségével mind az állatok, mind az emberek vérszérumában lévő antitestek (ismert antigénnel szenzitizált vörösvértestek felhasználásával) és antigén (bizonyos antitestekkel szenzitizált eritrociták használatával) kimutathatók . A reakcióhoz különböző állatfajok mosott eritrocitáit (leggyakrabban birka és csirke vörösvértestét) használják. Az eritrociták nagy molekulájú fehérje antigéneket adszorbeáló képessége megnövekszik, miután cserzőanyaggal kezelték őket. A vörösvértestek eltarthatóságának növelése érdekében formaldehiddel tartósítják őket. A formalizált eritrocitákból nyert diagnosztikai anyagok hosszú ideig megőrzik aktivitásukat. A kész eritrocita diagnosztika rendelkezésre állásával a reakció megfogalmazása jelentősen leegyszerűsödik. Az állatorvosi gyakorlatban az RNGA-t bizonyos (főleg vírusos) állatbetegségek diagnosztizálására használják - klasszikus baromfipestis - Newcastle-betegség, tehénhimlő, lóinfluenza, sertés- és kacsainfluenza, pullorosis - madártífusz stb. Lásd még.

Irodalom:
Laboratóriumi kutatás az állatgyógyászatban, M., 1971;
Kézikönyv a mikrobiológiai és virológiai módszerek Research, szerk. M. O. Birger, 2. kiadás, M., 1973.

Állatgyógyászati enciklopédikus szótár. - M.: "Szovjet Enciklopédia". Főszerkesztő V.P. Shishkov. 1981 .

Szinonimák:

Nézze meg, mi a "HAEMAGGLUTINÁCIÓ" más szótárakban:

hemagglutináció- hemagglutináció... Helyesírási szótár-kézikönyv

hemagglutináció- zsúfoltság, agglutigáció Orosz szinonimák szótára. hemagglutináció főnév, szinonimák száma: 2 agglutigáció (3) ... Szinonima szótár

HEMAGLUTINÁCIÓ- (hem... és lat. agglutinatio ragasztásból) folyadékban szuszpendált vörösvértestek ragasztása, kicsapása különféle szerek, például antitestek, baktériumok vagy vírusok hatására. A hemagglutinációs reakciót a diagnózis felállítására használják. Nagy enciklopédikus szótár

Hemagglutináció- a vörösvértestek szabad szemmel látható aggregátumokká történő ragasztásának folyamata. A G.-t a következők okozzák: 1) Vörösvértestek és heterofil Ag-ek ellenhatásai; 2) Antigén az eritrocitáktól idegen antigénekhez, felületükön adszorbeálódott (lásd Hemagglutinációs reakció, passzív); 3)... Mikrobiológiai szótár

HEMAGLUTINÁCIÓ- HEMAGGLUTINÁCIÓ, a vörösvértestek aglutinációja (csomósodása) homológ szérummal keverve. Ha az emberi vörösvérsejteket ugyanattól a személytől származó szérummal helyettesítjük, akkor felrázva egységes szuszpenziót kapunk. Ha egy ember vörösvérsejtjei...... Nagy Orvosi Enciklopédia

hemagglutináció- Az antitest-meghatározási módszer alapjául szolgáló jelenség, amely a vörösvértestek agglutinációján alapul, akár maguknak az eritrociták antigénjeinek, akár más, az eritrociták felszínéhez mesterségesen kötött antigéneknek a hatására.... Műszaki fordítói útmutató- (hem + agglutináció) vörösvértestek agglutinációja ... Nagy orvosi szótár

Hemagglutináció- görögből haima vér és lat. agglutinatio ragasztás), a ragasztás folyamata és a vörösvértestek ezt követő ülepedése; hemagglutininek (lásd Hemagglutininek), baktériumok és vírusok, olyan szerek, amelyek képesek adszorbeálódni... ... Nagy szovjet enciklopédia

hemagglutináció- a vörösvértestek ragasztása (agglutinációja). Kialakul, beleértve az összeférhetetlen vér transzfúziója során.