in der Mikrobiologie

„Agglutinationsreaktion und ihre Typen (RA)“

Planen:

1. Einleitung……………………………………………………………………………..3

2. RA auf Glas…………………………………………………………………………….4

3. Reagenzglas RA…………………………………………………………………………………….5

4. Verwendete Literatur………………………………………………………………..7

1. Einführung.

Das Zusammenspiel von mikrobiellem Antigen und Antikörpern ist streng spezifischer Natur und zielt im tierischen Körper darauf ab, den Erreger und seine Toxine zu neutralisieren. Die Wechselwirkung von Antigen und Antikörpern in vitro geht unter bestimmten Bedingungen mit sichtbaren Phänomenen einher (Agglutination, Ausfällung, Immunlyse), was die praktische Nutzung von AG-AT-Reaktionen, die als serologisch (vom lateinischen Serum) bezeichnet werden, ermöglicht. Biofabriken produzieren Antigene und Immunseren (Antikörper) bekannter spezifischer Natur (diagnostisch). Mit Hilfe solcher Seren kann in serologischen Reaktionen ein unbekannter Mikroorganismus identifiziert oder mit einem bekannten Antigen im Körper als Reaktion auf die Einschleppung des Erregers synthetisierte Antikörper nachgewiesen und somit eine Diagnose gestellt werden (serologische Diagnostik). ). Darüber hinaus kann anhand serologischer Reaktionen die Intensität der Immunantwort nach einer Impfung oder einer Infektionskrankheit beurteilt werden.

Agglutinationsreaktionen wie die indirekte Agglutination und Coombs basieren auf der In-vitro-Wechselwirkung korpuskulärer Antigene mit Antikörpern und der Fähigkeit der resultierenden Komplexe zur Ausfällung. Als korpuskuläre Antigene werden Bakterienzellen oder lösliche Antigene verwendet, die aus Mikroorganismen extrahiert und an Trägerkörperchen sorbiert werden: rote Blutkörperchen, Latexpartikel usw.

Antigene Determinanten korpuskulärer Antigene interagieren spezifisch mit homologen Antikörpern (spezifische, unsichtbare Phase der Reaktion), und dann bilden Antigen-Antikörper-Komplexe große, mit bloßem Auge sichtbare Konglomerate, die ausfallen – ein Agglutinat (unspezifische, sichtbare Phase der Reaktion). ). Flagellatenfreie Formen von Mikroben (Brucellae) produzieren körnige Agglutinationsmittel, während Flagellatenformen (Escherichia, Salmonella) große Baumwoll-Agglutinationsmittel produzieren, die sich in Form eines umgekehrten Regenschirms am Boden des Reagenzglases absetzen und beim Schütteln leicht zerbrechen. Antigene und Antikörper interagieren nur in Gegenwart eines Elektrolyten (0,8 % Natriumchloridlösung). Der Reaktionsverlauf wird durch die Salzkonzentration im Elektrolyten, die Anzahl der mikrobiellen Zellen in der Suspension, die Serumkonzentration, den pH-Wert, die Temperatur und andere Faktoren beeinflusst.

Agglutinationsreaktion (ra).

Es kommt zu spezifischen Agglutinationen, die auf der Wechselwirkung des Antigens beruhen Mit homologer Antikörper , im Körper des Tieres enthalten, in das dieses Antigen eingeführt wurde (Immunagglutination); unspezifisch (chemisch), aufgrund von Änderungen des pH-Werts der Umgebung und der Elektrolytkonzentration; spontan, was beobachtet wird, wenn Bakterien (in R-Form) in physiologischer Lösung suspendiert werden und wenn sie erhitzt werden, was mit einer Änderung des kolloidalen Zustands der Bakterienzelle verbunden ist. Antigen , Die an der RA beteiligten Substanzen werden als Agglutinogen bezeichnet, der Antikörper als Agglutinin und der entstehende Niederschlag als Agglutinat. Bei der Bildung eines Agglutinats ist das quantitative Verhältnis von Antigen und Antikörpern wichtig (das optimale Phänomen). Bei einem Überschuss oder Mangel an Antikörpern kommt es zu einer Verzögerung.

Die Agglutinationsreaktion (RA) ist eine der ersten immunologischen Reaktionen, die in der mikrobiologischen Praxis eingesetzt werden. Zum ersten Mal (1895) verwendete F. Vidal RA zur Diagnose von Typhus. Später (1897) verwendete A. Wright dieselbe Reaktion, um Brucellose beim Menschen zu diagnostizieren. RA hat auch Anwendung bei der Diagnose von Hühnerpullorose, Leptospirose, infektiösem Abort bei Stuten sowie zur Typisierung unbekannter mikrobieller Kulturen unter Verwendung eines bekanntermaßen agglutinierenden Serums gefunden. RA ist hochsensibel; Es kann zum Nachweis von 0,01 μg Antikörperproteinstickstoff in 1 ml verwendet werden.

Es wurden mehrere Varianten der Agglutinationsreaktion entwickelt, die sich in der methodischen Umsetzung und dem Zweck der Studie unterscheiden.

2. Ra auf Glas.

Bei dieser RA-Variante können die Testpersonen entweder Serum oder Antigen sein, am häufigsten wird diese Option jedoch zur Identifizierung von Mikroorganismen verwendet.

1. Zur Identifizierung des Mikroorganismus (m/o) werden ein Tropfen eines bekannten agglutinierenden Serums, beispielsweise Salmonella-Serum, und ein Tropfen physiologischer Lösung (Kontrolle) getrennt auf einen fettfreien Glasobjektträger aufgetragen. Anschließend wird mithilfe einer bakteriologischen Schleife die Bakterienmasse der untersuchten Kultur einer Kolonie in einer Petrischale oder von der Oberfläche eines schrägen MPA in einem Reagenzglas entnommen und getrennt in Immunserum und physiologischer Lösung suspendiert, bis eine homogene Suspension entsteht erhalten. Das Ergebnis wird nach 2...4 Minuten berücksichtigt.

Berücksichtigung der Ergebnisse: Es sollten keine Änderungen in der Kontrollprobe auftreten. Wenn die Bakterienkultur spezifisch mit dem Immunserum übereinstimmt, treten Agglutinationsflocken auf (positives Ergebnis); liegt kein Agglutinationsphänomen vor, wird geschlossen, dass die untersuchte Bakterienkultur nicht dem Immunserum entspricht.

2. Betrachten wir den Nachweis von Anittel im Testblutserum am Beispiel des Bengalrosa-Tests, der bei der Serodiagnose von Brucellose eingesetzt wird. 0,3 ml des Testtierblutserums und 0,03 ml Brucellose-Antigen (Rose-Bengal-gefärbte Brucella-Zellen) werden auf einen Glasobjektträger aufgetragen. Durch Schütteln des Glases werden die Komponenten gründlich vermischt und das Ergebnis nach 4 Minuten berücksichtigt.

Protokollierung des Ergebnisses: Bei positiver Reaktion erscheinen rosafarbene Agglutinatflocken. Eine solche serologische Reaktion wird als qualitativ eingestuft, da mit ihr zwar Antikörper gegen den Erreger im Blutserum des Tieres nachgewiesen, deren quantitativer Gehalt jedoch nicht beurteilt werden kann.

Die Agglutinationsreaktion basiert auf der spezifischen Interaktion von Antikörpern (Agglutininen) mit ganzen mikrobiellen oder anderen Zellen. Durch diese Wechselwirkung entstehen Agglomeratpartikel, die ausfallen (agglutinieren). Bakterien, Protozoen, Pilze, Hefen, Rickettsien, Erythrozyten und andere Zellen, sowohl lebende als auch abgetötete, können an der Agglutinationsreaktion beteiligt sein. Die Reaktion verläuft in zwei Phasen: Die erste ist eine spezifische Kombination von Antigen und Antikörper, die zweite ist unspezifisch, d. h. die Bildung eines sichtbaren Agglutinats. Die Ausfällung von Agglutinat erfolgt in Gegenwart von Elektrolyten wie Natriumchlorid. Die Mikroorganismen im Agglutinat bleiben am Leben, verlieren jedoch ihre Beweglichkeit.

Die Agglutinationsreaktion wird häufig zur serologischen Diagnostik eingesetzt Infektionskrankheiten und Bestimmung der Antigenstruktur isolierter Mikroben. Um die Antigenstruktur eines aus dem Körper eines Patienten oder Trägers isolierten Erregers zu bestimmen, wird spezifisches Immunserum verwendet, das durch Immunisierung von Tieren (Kaninchen, Esel, Schafe) mit bestimmten Mikroorganismen gewonnen wird. Die Identifizierung der Mikrobe erfolgt durch eine Agglutinationsreaktion auf Glas mit adsorbierten oder Monorezeptor-Seren oder in Reagenzgläsern mit spezifischen Agglutinationsseren. Adsorbierte Seren enthalten Antikörper nur gegen Antigene, die für eine bestimmte Mikrobe spezifisch sind, und Monorezeptor-Seren enthalten Antikörper nur gegen eines spezifisches Antigen Erreger.

Artenseren enthalten Antikörper gegen alle Antigene einer bestimmten Mikrobe.

Die Zugehörigkeit einer isolierten Mikroorganismenkultur zu einer bestimmten Art wird durch Agglutination mit einem bekannten Serum bis zum auf dem Etikett der Serumampulle angegebenen Antikörpertiter bestimmt. Als Antikörpertiter eines Serums gilt die letzte Verdünnung, bei der noch eine Agglutination der zur Immunisierung des Tieres verwendeten Mikrobenkultur beobachtet wird. Adsorbierte und Monorezeptorseren werden in der Glasagglutinationsreaktion üblicherweise unverdünnt eingesetzt.

Um das Vorhandensein von Antikörpern im Blutserum des Patienten festzustellen, wird es mit einer isotonischen Natriumchloridlösung verdünnt, beginnend mit einer Verdünnung von 1:50 bis 1:800 oder mehr. Jeder Verdünnung wird eine Suspension lebender oder abgetöteter Mikroben zugesetzt. Präparate, die durch Hitze oder Formaldehyd abgetötete Mikroben enthalten, werden Diagnostika genannt. Durch Erhitzen von Mikroorganismenkulturen gewonnene Diagnostika enthalten ausschließlich somatische Antigene. Wenn nur Formaldehyd verwendet wird, behalten Mikroben ihre Flagellenantigene.

Bei Vorhandensein von Antikörpern im Blut des Patienten verklebt das bei der Reaktion entnommene Diagnostikum und es bildet sich ein Bodensatz (Agglutinat) auf zwei Reagenzgläsern. In diesem Fall gelten die Ergebnisse der Agglutinationsreaktion als positiv. Im Kontrollröhrchen, in das isotonische Natriumchloridlösung und Diagnostikum gegeben werden, sollte die Mikrobensuspension homogen sein (negative Agglutinationsreaktion).

Die Ergebnisse der Agglutinationsreaktion werden bei manchen Erkrankungen, beispielsweise der Leptospirose, nur mikroskopisch im dunklen Sichtfeld eines Mikroskops berücksichtigt (Mikroagglutination). Um eine serologische Diagnose einer Krankheit zu stellen, berücksichtigen Sie Folgendes diagnostische Krankheit. Sie entspricht in der Regel einer Serumverdünnung von 1:100 oder 1:200.

Antikörper im Blutserum des Patienten können anhand der Agglutinationsreaktion bei Typhus und Paratyphus (Vidal-Reaktion), Brucellose (Wright-Reaktion), Tularämie usw. nachgewiesen werden.
Castellanis Reaktion. Bei bestimmten Infektionskrankheiten oder bei der Immunisierung mit Mikroorganismen Gruppenantigene Im Blutserum treten neben den für diesen Typ spezifischen Antikörpern auch Gruppenantikörper auf. In diesem Fall werden verwandte Bakterienarten durch die resultierenden Seren agglutiniert.

Castellani schlug eine Methode zur Adsorption von Gruppenantikörpern aus Immunseren vor, die auf deren Entfernung mit Hilfe von Mikroorganismen verwandter Arten beruhte, die über Gruppenantigene, aber keine spezifischen Antigene verfügen. Eine dem Serum zugesetzte Kultur solcher Mikroorganismen adsorbiert unspezifische Gruppenantikörper, und nach Entfernung des Antigen-Antikörper-Komplexes durch Zentrifugation verbleiben nur noch spezifische Immunglobuline im Serum. Nach der Castellani-Methode aufbereitete Seren können hochspezifisch in der Agglutinationsreaktion eingesetzt werden.

Ziel: Beherrschen Sie die Technik der Durchführung von Agglutinationsreaktionen und Niederschlagsreaktionen zur Diagnose von Infektionskrankheiten.

Modul 1. Morphologie und Physiologie von Mikroorganismen. Infektion. Immunität.

Thema 16: Agglutinationsreaktion. Niederschlagsreaktion.

Relevanz des Themas. Unter Immunität implizieren die Immunität des Körpers gegen infektiöse und nichtinfektiöse Erreger ( pathogene Mikroorganismen, Fremdproteine ​​und andere Substanzen). Diese Wirkstoffe werden Antigene genannt. Immunität kann angeboren oder erworben sein. Angeboren– wenn Gewebe- und humorale Schutzvorrichtungen gebildet werden, die eine Immunität gegen vererblich übertragene Infektionskrankheiten bewirken.

Erworben– durch das körpereigene Immunsystem in Form der Produktion von Antikörpern oder der Ansammlung sensibilisierter Lymphozyten durchgeführt. Es ist unterteilt in natürlich und künstlich. Nach dem Wirkmechanismus wird es unterteilt in: aktiv und passiv. Alles in allem immunologische Reaktionen Der Hauptbestandteil ist das Antigen.

Hauptfunktion Immunsystem, bestehend aus Lymphgewebe ist die Erkennung fremder Erreger (Antigene) und deren Neutralisierung.

Antigene können dadurch in den Körper gelangen Atemwege, Verdauungstrakt, durch die Haut und Schleimhäute. Jedes Antigen stimuliert die Bildung spezieller Eiweißstoffe – Antikörper.

Antigene werden in vollständige und minderwertige (Haptene) unterteilt. Vollständige Antigene eine vollständige Immunantwort auslösen. Defekte Antigene Sie induzieren selbst keine Immunantwort, erwerben diese Fähigkeit jedoch manchmal, wenn sie mit Proteinträgern mit hohem Molekulargewicht konjugiert werden. Darüber hinaus gibt es Antigene: Hemihaptene, Proantigene, Heteroantigene und Isoantigene.

Antikörper sind Immunglobuline aus menschlichem oder tierischem Blutserum. Antikörper werden nach einer Infektion und als Folge einer Immunisierung mit abgeschwächten oder abgetöteten Bakterien, Rickettsien, Viren, Toxinen und anderen Erregern gebildet. Antikörper– Immunglobulin-Proteine chemische Zusammensetzung gehören zu den Glykoproteinen. Aufgrund ihrer Struktur und immunbiologischen Eigenschaften werden Immunglobuline in unterteilt 5 Klassen: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Normale Antikörper kommt bei Menschen und Tieren vor, die nicht geimpft sind. Spezifische Antikörper entstehen als Folge einer Infektion oder Impfung.

Die Reaktion zwischen einem Antikörper und einem Antigen nennt man serologisch. Serologische Tests sind hochspezifisch und werden bei der Diagnose vieler Infektionskrankheiten eingesetzt. Man unterscheidet zwischen Agglutinations- und Fällungsreaktionen.

1. Agglutinationsreaktion (RA) basiert auf der Wechselwirkung eines Antigens (Agglutinogen) und eines Antikörpers (Agglutinin), bei der mikrobielle Körper zusammenkleben und in Gegenwart eines Elektrolyten ausfallen. Es gibt verschiedene Modifikationen der Agglutinationsreaktion.

Höchster Wert haben:

- Makroskopische (erweiterte) Agglutination in Reagenzgläsern. Dem Serum des Patienten wird eine Mikrobensuspension (Diagnosticum) zugesetzt und nach einer Stunde in einem Thermostat bei einer Temperatur von 37 Grad wird die Verdünnung (Titer) des Serums notiert, bei der die Reaktion auftrat. Eine Agglutinationsreaktion gilt als positiv, wenn sich am Boden des Reagenzglases ein Niederschlag mit deutlicher Klärung der überstehenden Flüssigkeit bildet. Dieser Niederschlag wird Agglutinat genannt.

Anhand der Art des Agglutinats wird zwischen feinkörniger (O) und grobkörniger (H) Agglutination unterschieden. Zur Identifizierung feinkörniger Agglutinate wird ein Agglutinoskop verwendet. Die Aufzeichnung der Ergebnisse beginnt mit Kontrollröhrchen. Als Titer gilt die letzte Verdünnung des Serums, bei der eine Agglutination beobachtet wird.

Zweck der Reaktion: Nachweis von Antikörpern im Serum des Patienten.

- Mikroskopisch (beschleunigt ) ungefähre Agglutination auf Glas. Ein Tropfen Bakterienkultur wird zu einem Tropfen diagnostischem Immunserum gegeben und gleichmäßig vermischt. Die Reaktion erfolgt bei Raumtemperatur in 5–10 Minuten. Dann ist die Abrechnung erledigt. Bei positiver Reaktion ist im Serumtropfen eine Ansammlung von Bakterien in Form von Körnern oder Flocken zu erkennen. Zweck der Reaktion: Bestimmung des Erregertyps anhand eines bekannten diagnostischen Serums.

- Indirekte (passive) Hämagglutinationsreaktion (IRHA). Der Kern dieser Reaktion besteht darin, dass die roten Blutkörperchen von Schafen in der Lage sind, Antigene auf ihrer Oberfläche zu adsorbieren. Unter dem Einfluss spezifischer Antikörper kleben rote Blutkörperchen zusammen und fallen aus, wobei sich am Boden Hämagglutinat bildet. Die Reaktion ist hochsensibel und spezifisch. Mit RNGA können Sie eine minimale Menge an Antikörpern und defekten Antigenen mit Polysaccharidcharakter nachweisen. Diese Reaktion wird bei der Diagnose vieler Infektionskrankheiten (Typhus und Typhus, Paratyphus, Tuberkulose usw.) verwendet.

2. Fällungsreaktion (RP ) – Ausfällung des Antigen-Antikörper-Komplexes. Der Hauptunterschied zwischen RP und RA besteht darin, dass bei RA ein korpuskuläres Antigen verwendet wird, während bei RP das Antigen eine kolloidale Substanz mit Protein- oder Polysaccharidcharakter ist. Bei dieser Reaktion wird das Antigen als Präzipitinogen und die Antikörper als Präzipitine bezeichnet. Die Reaktion wird in Reagenzgläsern durchgeführt, indem die Antigenlösung auf das Immunserum aufgetragen wird. Mit einem optimalen Verhältnis von Antigen und Antikörpern an der Grenze

Diese Lösungen bilden einen Niederschlagsring. Wenn als Antigen gekochte und gefilterte Extrakte von Organen und Geweben verwendet werden, spricht man von einer Thermopräzipitationsreaktion (Ascoli-Reaktion, die bei der Diagnose von Milzbrand, Pest, Tularämie usw. verwendet wird).

Fällungsreaktionen in Agar sind weit verbreitet: einfache Diffusionsmethode, doppelte Diffusionsmethode.

Eine Art Niederschlag ist Flockungsreaktion– zur Bestimmung der Aktivität von Toxoid- oder antitoxischem Serum. Darüber hinaus kann diese Reaktion zur Bestimmung der Toxigenität von Corynebacterium diphtheriae-Stämmen verwendet werden.

Konkrete Ziele:

· Erklären Sie die Rolle von Antigenen als Auslöser einer Immunantwort;

· Beschreiben Sie die Struktur von Antigenen, einschließlich der Antigene von Mikroorganismen;

· Beschreiben Sie den Mechanismus der Agglutinationsreaktion;

· Beschreiben Sie den Mechanismus der Fällungsreaktion.

In der Lage sein:

· Erklären Sie die Rolle von Antigenen als Auslöser einer Immunantwort;

· Beschreiben Sie die Struktur von Antikörpern (verschiedene Klassen von Immunglobulinen);

· Analysieren Sie den Mechanismus der Interaktion von Antikörpern mit Antigenen.

· Interpretieren Sie die Ergebnisse der Agglutinationsreaktion;

· Interpretieren Sie die Ergebnisse der Fällungsreaktion;

· Analysieren Sie die erzielten Ergebnisse.

Theoretische Fragen:

1. Definition des Begriffs „Antigene“, „Antikörper“.

2. Die Rolle von Antigenen als Auslöser der Immunantwort.

3. Struktur von Antikörpern (verschiedene Klassen von Immunglobulinen).

4. Der Mechanismus der Wechselwirkung von Antikörpern mit Antigenen.

5. Immunreaktionen, ihre Rolle bei der Immunantwort und Diagnose von Infektionskrankheiten.

6. Mechanismus der Agglutinationsreaktion.

7. Mechanismus der Fällungsreaktion.

Praktische Aufgaben im Unterricht:

1. Durchführung einer Agglutinationsreaktion zum Nachweis von Antikörpern im Serum des Patienten.

2. Einrichtung einer Mikroagglutinationsreaktion auf Glas mit Diagnoseseren zur Identifizierung einer reinen Bakterienkultur.

3. Auswertung der Ergebnisse der Agglutinationsreaktion.

4. Einrichten einer Fällungsreaktion zum Nachweis von bakteriellem Antigen.

5. Auswertung der Ergebnisse der Fällungsreaktion.

6. Auswertung der Ergebnisse der indirekten Hämagglutinationsreaktion.

7. Erstellung des Protokolls.

Literatur:

1. Pyatkin K.D., Krivoshein Yu.S. Mikrobiologie mit Virologie und Immunologie – Kiew: Handelshochschule, 1992.- 431 S.

2. Vorobyov A.V., Bykov A.S., Pashkov E.P., Rybakova A.M. Mikrobiologie.- M.: Medizin, 1998.- 336 S.

3. Medizinische Mikrobiologie /Herausgegeben von V.P. Pokrovsky. – M.: GEOTAR-MED, 2001. – 768 S.

4. Korotyaev A.I., Babichev S.A. Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Virologie / Lehrbuch für medizinische Universitäten, St. Petersburg: „Spezielle Literatur“, 1998.- 592 S.

5. Timakov V.D., Levashev V.S., Borisov L.B. Mikrobiologie / Lehrbuch – 2. Aufl., überarbeitet. und zusätzlich – M.: Medizin, 1983.- 512 S.

6. Vorlesungsskript.

Weiterführende Literatur:

1. Titov M.V. Infektionskrankheiten.- K., 1995.– 321 S.

2. Shuvalova E.P. Infektionskrankheiten. – M.: Medizin, 1990.- 559 S.

Agglutinationsreaktion Agglutinationsreaktion

(RA) ist eine Methode zur Identifizierung und Quantifizierung von Ag und Ab, basierend auf ihrer Fähigkeit, mit bloßem Auge sichtbare Agglomerate zu bilden. In der Abteilung für Infektionskrankheiten. Krankheiten oder für andere Zwecke wird zur Identifizierung unbekannter Mikroben und Zellen sowie zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Menge von Antikörpern im Blut und anderen Flüssigkeiten verwendet. Das Bestimmungsprinzip basiert auf der Spezifität der Wechselwirkung zwischen Ag und Ab und besteht darin, das Bekannte aus dem Unbekannten zu finden. Es gibt viele Optionen für RA: quantitative und qualitative, Reagenzglas- und Glas-, volumetrische und Tröpfchen-, konventionelle, beschleunigte und Express-Methoden. Um RA zu inszenieren, benötigen Sie: 1) S-ka-Blut. Bei der Variante zur Bestimmung der Bakterienart (var) kommen industrielle Agglutinationstests zum Einsatz, die durch Immunisierung von Kaninchen hergestellt werden. Bei der Variante mit Bestimmung des Antikörpertyps wird dem Test eine Blutprobe entnommen. Menschen oder Tiere. Die Lösung muss steril und frei von Schwebstoffen sein. Bereiten Sie die Grundverdünnung in Kochsalzlösung vor. Er sollte 2–4 Mal niedriger sein als der diagnostische Titer für diese Krankheit; 2) Ag. Bei der Variante der Reaktion mit Bestimmung des Ab-Typs werden industrielle Diagnosekits verwendet; In der Variante mit der Bestimmung von Ag werden Diagnostika selbst in Form einer 1-3-Milliarden-Suspension in einer Salzlösung von 18-20-Stunden-Agar-Test (seltener Brühe) hergestellt. Mikrobe inaktiviert durch einstündiges Erhitzen in einem Wasserbad auf 70 °C oder durch 24-stündige Inkubation bei 37 °C mit Formaldehyd (Endkonzentration 0,2 %); 3) Elektrolyt in Form einer Salzlösung. Inszenierungstechnik volumetrisches serielles Rohr RA zur Bestimmung des Ab-Titers in s-ki: Aus der Hauptverdünnung von s-ki werden mehrere Reihen Arbeitsverdünnungen hergestellt. Die Anzahl der Reihen hängt von der Anzahl der im Experiment verwendeten Diagnostika ab; die Anzahl und Verdünnungsfaktoren richten sich nach dem diagnostischen Titer der vermuteten Krankheit. Die Serie muss mindestens eine Verdünnung enthalten, die dem diagnostischen Ab-Titer entspricht, zwei Verdünnungen darunter und zwei Verdünnungen darüber. Wenn der diagnostische Titer beispielsweise 1:100 beträgt, sollten mit der volumetrischen Methode des RA-Staging die folgenden Verdünnungen hergestellt werden: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400; mit dem Tropf Bei dieser Methode ist die erste Verdünnung (1:25) nicht erforderlich, es ist jedoch eine weitere höhere Verdünnung erforderlich – 1:800 B. wissenschaftliche Forschung s-ku wird auf eine negative Reaktion titriert. Es wird wie folgt verdünnt: 0,25 ml Kochsalzlösung werden in alle Reagenzgläser außer dem 1. gegossen, wenn die Reaktion in einem Volumen von 0,5 ml durchgeführt wird, und 0,5 ml, wenn die Reaktion in einem Volumen von 1 durchgeführt wird ml. Gießen Sie 0,25 (0,5) ml der Hauptverdünnung in das 1. und 2. Reagenzglas, aus dem 2. Reagenzglas in das Schnittvolumen und und 2-fach erhöht, 0,25 (0,5) ml werden in den 3., vom 3. in den 4. usw. überführt. bis zum Schluss werden vom Schnitt 0,25 (0,5) ml in alles gegossen, um die Volumina auszugleichen. Jede Verdünnung wird mit einer separaten Pipette durchgeführt. Werden mehrere Diagnostika in den Versuch genommen, so wird für jedes Diagnostikum in gleicher Weise eine eigene Verdünnungsreihe hergestellt. Jeder Verdünnung des Reagenzglases wird Diagnosticum in einem Volumen zugesetzt, das dem Volumen des Reagenzglases entspricht, wodurch sich die Verdünnung in jedem Reagenzglas verdoppelt. Der Versuch entspricht der S-Ki-Kontrolle (0,25 – 0,5 ml der Hauptverdünnung von S-Ki und der gleichen Menge Kochsalzlösung) und der Ag-Kontrolle (0,25 – 0,5 ml Diagnostikum und der gleichen Menge Kochsalzlösung). Werden im Experiment mehrere Diagnostika verwendet, so verfügt jedes über eine eigene Antigenkontrolle. Das Gestell mit den Reagenzgläsern wird gut geschüttelt und 4 Stunden lang bei 37 °C in einen Thermostat gestellt und dann bis zum nächsten Tag bei Raumtemperatur belassen. Anschließend wird der PA basierend auf der Sedimentmenge und dem Grad der Klärung aufgezeichnet die Flüssigkeit. Die Bestimmung dieser Indikatoren erfolgt je nach Art der Agglutinate mit bloßem Auge vor dunklem Hintergrund, im Agglutinoskop oder über der konkaven Oberfläche eines Mikroskopspiegels. Die Abrechnung beginnt mit den Kontrollen: Kontrolle C sollte transparent sein, Ag sollte gleichmäßig trüb sein (nach Schütteln des Röhrchens). Wenn die Kontrollen gut sind, stellen Sie das Vorhandensein und den Grad der Agglutination in allen Reagenzgläsern fest, die durch Pluspunkte gekennzeichnet sind: großes Sediment und vollständige Klärung der Flüssigkeit – 4 Pluspunkte; großes Sediment und unvollständige Reinigung der Flüssigkeit - 3 Pluspunkte; Deutlicher Bodensatz und spürbare Klärung der Flüssigkeit sind zwei Pluspunkte. Anschließend wird der Titer bestimmt: die höchste Verdünnung mit einer Agglutinationsintensität von mindestens 2 Plus. Titerforschung s-ki werden mit dem diagnostischen Titer für diese Krankheit verglichen. Wenn der Titer untersucht wird. s-ki ist 2-mal niedriger als der diagnostische Wert, die Reaktion wird als zweifelhaft bewertet; wenn der Titer dem diagnostischen entspricht – als schwach positiv; ist er 2-4 mal höher, gilt er als positiv; ist er 8-mal oder mehr, gilt er als deutlich positiv. Mit der weiten Verbreitung von Ab gesunde Menschen Zur Beurteilung der RA wird eine Erhöhung des Ab-Titers herangezogen. Um den Ar-Typ im seriellen RA zu bestimmen, muss die Anzahl der Zeilen mit der zur Identifizierung verwendeten Nummer übereinstimmen diagnostische Tests. Aus der Hauptverdünnung des Diagnosetests werden auf die gleiche Weise wie bei RA eine Reihe aufeinanderfolgender Zweifachverdünnungen hergestellt, um den Ab-Titer zu bestimmen. Die Verdünnungsfaktoren hängen vom Titer des Agglutinationstests ab. Im Experiment ist das Vorhandensein einer Verdünnung erforderlich, die dem Titer des Tests entspricht und beispielsweise um das 2-, 4-, 6- oder 8-fache niedriger ist Wenn der Titer des diagnostischen Tests 1 3200 beträgt, sollten Sie die Verdünnungen 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 verwenden. Den Verdünnungen des Tests wird die gleiche Menge an getestetem Ag zugesetzt, was zu einer Verdünnung von führt Der Test wird um das 2-fache erhöht. Wenn am Experiment mehrere S-K beteiligt sind, muss jeder von ihnen seine eigene Kontrolle haben. Nach Abschluss der Reaktion wird der Ständer kräftig geschüttelt in einem Thermostat bei 37°C. Die Ergebnisse werden wie oben beschrieben berücksichtigt, um einen Rückschluss auf die Übereinstimmung der Studie zu ziehen. Wenn Ag in das Experiment eingebracht wird, muss der Titer der Reaktion mindestens der Hälfte des Titers des Standarddiagnostiktests entsprechen. Titer von 1 bis 4 gelten als Gruppenreaktion Drip md Die Einstufung der RA unterscheidet sich von der volumetrischen Einstufung darin, dass s-ku in einem Volumen von 1 ml verdünnt wird, Ag in einer höheren Konzentration (10 Milliarden/ml) verwendet und jeweils einzeln zugegeben wird - 2 Tropfen in ein Reagenzglas. Die Verdünnung des Arzneimittels nach Zugabe von Ag gilt als unverändert. Ansonsten ähnelt die Einstellungs-, Aufzeichnungs- und Auswertungsmethode der volumetrischen Methode

(Quelle: Dictionary of Microbiology Terms)

13.1. Antigen-Antikörper-Reaktionen und ihre Anwendungen

Wenn ein Antigen eingeführt wird, werden im Körper Antikörper gebildet. Antikörper sind komplementär zu dem Antigen, das ihre Synthese verursacht hat, und können daran binden. Die Bindung von Antigenen an Antikörper besteht aus zwei Phasen. Die erste Phase ist spezifisch, in der eine schnelle Bindung der antigenen Determinante an das aktive Zentrum des Fab-Fragments von Antikörpern erfolgt. Es ist zu beachten, dass die Bindung auf Van-der-Waals-Kräfte, Wasserstoff und hydrophobe Wechselwirkungen zurückzuführen ist. Die Stärke der Bindung wird durch den Grad der räumlichen Übereinstimmung zwischen dem aktiven Zentrum des Antikörpers und dem Epitop des Antigens bestimmt. Nach der spezifischen Phase beginnt eine langsamere Phase – unspezifisch, die sich in einem sichtbaren physikalischen Phänomen äußert (z. B. Flockenbildung beim Agglutinieren etc.).

Bei Immunreaktionen handelt es sich um Wechselwirkungen zwischen Antikörpern und Antigenen. Diese Reaktionen sind spezifisch und hochempfindlich. Sie werden häufig verwendet medizinische Praxis. Mit Hilfe von Immunreaktionen können folgende Probleme gelöst werden:

Bestimmung unbekannter Antikörper anhand bekannter Antigene (Antigendiagnostik). Diese Aufgabe entsteht, wenn es darum geht, Antikörper gegen einen Erreger im Blutserum des Patienten zu bestimmen (Serodiagnostik). Durch den Nachweis von Antikörpern können Sie die Diagnose bestätigen;

Bestimmung unbekannter Antigene anhand bekannter Antikörper (diagnostisches Serum). Diese Studie wird bei der Identifizierung einer aus Patientenmaterial isolierten Erregerkultur (Serotypisierung) sowie beim Nachweis durchgeführt

mikrobielle Antigene und ihre Toxine im Blut und anderen biologischen Flüssigkeiten. Es gibt viele Arten von Immunreaktionen, die sich in der Technik der Stadieneinteilung und der aufgezeichneten Wirkung unterscheiden. Dies sind Agglutinationsreaktionen (RA), Fällungsreaktionen (RP), Reaktionen mit Komplementbeteiligung (RSC), Reaktionen unter Verwendung markierter Komponenten (RIF, ELISA, RIA).

13.2. Agglutinationsreaktion

Eine Agglutinationsreaktion (RA) ist eine Immunreaktion der Wechselwirkung eines Antigens mit Antikörpern in Gegenwart von Elektrolyten und das Antigen befindet sich in einem korpuskulären Zustand (rote Blutkörperchen, Bakterien, Latexpartikel mit adsorbierten Antigenen). Bei der Agglutination werden korpuskuläre Antigene durch Antikörper zusammengeklebt, was sich in der Bildung eines flockigen Niederschlags äußert. Die Bildung von Flocken erfolgt aufgrund der Tatsache, dass Antikörper zwei aktive Zentren haben und Antigene polyvalent sind, d. h. haben mehrere antigene Determinanten. RA wird verwendet, um den aus dem Material des Patienten isolierten Erreger zu identifizieren und um Antikörper gegen den Erreger im Blutserum des Patienten nachzuweisen (z. B. die Wright- und Heddleson-Reaktionen bei Brucellose, die Widal-Reaktion bei Typhus und Paratyphus).

Der einfachste Weg, RA zu diagnostizieren, ist die Reaktion auf Glas; dabei handelt es sich um eine ungefähre RA, die zur Bestimmung des aus dem Patienten isolierten Erregers dient. Wenn eine Reaktion festgestellt wird, wird diagnostisches agglutinierendes Serum auf einen Objektträger aufgetragen (in einer Verdünnung von 1:10 oder 1:20) und dann eine Kultur des Patienten hinzugefügt. Die Reaktion ist positiv, wenn sich im Tropfen ein flockiger Bodensatz bildet. In der Nähe wird eine Kontrolle platziert: Anstelle von Serum wird ein Tropfen Natriumchloridlösung aufgetragen.

Wenn das diagnostische agglutinierende Serum nicht adsorbiert wird 1, wird es verdünnt (auf den Titer – die Verdünnung, bis zu der die Agglutination erfolgen soll), d. h. Geben Sie expandiertes RA mit zunehmender Menge in Reagenzgläser1 Nicht adsorbiertes agglutinierendes Serum kann verwandte Bakterien mit gemeinsamen (kreuzreagierenden) Antigenen agglutinieren. Deshalb verwenden sie aus dem kreuzreagierende Antikörper durch Adsorption an verwandte Bakterien entfernt wurden. Solche Seren enthalten Antikörper, die nur für ein bestimmtes Bakterium spezifisch sind.

Verdünnungen von agglutinierendem Serum, denen 2-3 Tropfen einer Suspension des aus dem Patienten isolierten Erregers zugesetzt werden. Die Agglutination wird durch die Sedimentmenge und den Grad der Klärung der Flüssigkeit in den Reagenzgläsern berücksichtigt. Die Reaktion gilt als positiv, wenn eine Agglutination in einer Verdünnung beobachtet wird, die nahe am Titer des diagnostischen Serums liegt. Die Reaktion wird von Kontrollen begleitet: Das mit isotonischer Natriumchloridlösung verdünnte Serum sollte transparent sein, die Mikrobensuspension in derselben Lösung sollte gleichmäßig trüb sein, ohne Sediment.

Um Antikörper gegen den Erreger im Blutserum des Patienten zu bestimmen, wird eine vollständige RA eingesetzt. Bei der Zubereitung wird das Blutserum des Patienten in Reagenzgläsern verdünnt und eine gleiche Menge Diagnostikumsuspension (Suspension abgetöteter Mikroben) in die Reagenzgläser gegeben. Nach der Inkubation wird die höchste Serumverdünnung bestimmt, bei der eine Agglutination auftrat, d. h. Es hat sich ein Niederschlag (Serumtiter) gebildet. In diesem Fall erfolgt die Agglutinationsreaktion mit O-diagnosticum (durch Erhitzen abgetötete Bakterien unter Beibehaltung des thermostabilen O-Antigens) in Form einer feinkörnigen Agglutination. Die Agglutinationsreaktion mit H-diagnosticum (durch Formaldehyd abgetötete Bakterien unter Beibehaltung des thermolabilen Flagellen-H-Antigens) ist grob und verläuft schneller.

Indirekte (passive) Hämagglutinationsreaktion(RNGA oder RPGA) ist eine Art von RA. Diese Methode ist sehr empfindlich. Mit Hilfe von RNGA können zwei Probleme gelöst werden: Bestimmung von Antikörpern im Blutserum des Patienten, denen ein antigenes Erythrozytendiagnostum zugesetzt wird, also Erythrozyten, an denen bekannte Antigene adsorbiert sind; Bestimmen Sie das Vorhandensein von Antigenen im Testmaterial. In diesem Fall wird die Reaktion manchmal als umgekehrte indirekte Hämagglutinationsreaktion (RONHA) bezeichnet. Während des Verfahrens wird dem Untersuchungsmaterial ein Antikörper-Erythrozyten-Diagnostum (Erythrozyten mit an ihrer Oberfläche adsorbierten Antikörpern) zugesetzt. Bei dieser Reaktion fungieren rote Blutkörperchen als Träger und sind passiv an der Bildung von Immunaggregaten beteiligt. Bei einer positiven Reaktion bedecken passiv geklebte rote Blutkörperchen den Boden des Lochs in einer gleichmäßigen Schicht mit gewellten Rändern („Regenschirm“); Ohne Agglutination sammeln sich rote Blutkörperchen in der zentralen Aussparung des Lochs und bilden einen kompakten „Knopf“ mit scharf definierten Kanten.

Koagglutinationsreaktion dient zur Bestimmung von Krankheitserregerzellen (Antigenen) anhand von daran adsorbierten Antikörpern Staphylococcus aureus, enthält Protein A. Protein A hat eine Affinität zum Fc-Fragment von Immunglobulinen. Dadurch binden Antikörper indirekt über das Fc-Fragment an Staphylokokken, und Fab-Fragmente sind nach außen gerichtet und können mit den entsprechenden aus Patienten isolierten Mikroben interagieren. Dabei bilden sich Flocken.

Hämagglutinationshemmungsreaktion (HAI) in der Diagnostik eingesetzt Virusinfektionen und nur Infektionen, die durch hämagglutinierende Viren verursacht werden. Diese Viren enthalten auf ihrer Oberfläche ein Protein – Hämagglutinin, das für die Hämagglutinationsreaktion (HRA) verantwortlich ist, wenn den Viren rote Blutkörperchen hinzugefügt werden. Bei RTGA werden virale Antigene mit Antikörpern blockiert, wodurch Viren ihre Fähigkeit verlieren, rote Blutkörperchen zu agglutinieren.

Coombs-Reaktion - RA zur Bestimmung unvollständiger Antikörper. Bei manchen Infektionskrankheiten, etwa Brucellose, zirkulieren im Blutserum des Patienten unvollständige Antikörper zum Erreger. Unvollständige Antikörper werden blockierende Antikörper genannt, weil sie eine Antigenbindungsstelle haben und nicht zwei, wie vollständige Antikörper. Wenn daher ein antigenes Diagnostikum hinzugefügt wird, binden unvollständige Antikörper an Antigene, verkleben diese jedoch nicht. Um die Reaktion zu manifestieren, wird Antiglobulinserum (Antikörper gegen menschliche Immunglobuline) zugesetzt, was zur Agglutination der im ersten Stadium der Reaktion gebildeten Immunkomplexe (Antigendiagnostik + unvollständige Antikörper) führt.

Die indirekte Coombs-Reaktion wird bei Patienten mit verwendet intravaskuläre Hämolyse. Bei einigen dieser Patienten werden unvollständige monovalente Anti-Rhesus-Antikörper nachgewiesen. Sie interagieren spezifisch mit Rh-positiven Erythrozyten, verursachen jedoch keine deren Agglutination. Daher wird dem System Anti-Rh-Antikörper + Rh-positive Erythrozyten Antiglobulin-Serum zugesetzt, was eine Agglutination der Erythrozyten verursacht. Zur Diagnose dient der Coombs-Test pathologische Zustände, verbunden mit intravaskulärer Lyse von Erythrozyten immunologischen Ursprungs, zum Beispiel hämolytische Erkrankung bei Neugeborenen, die durch einen Rh-Konflikt verursacht wird.

RA zur Bestimmung der Blutgruppe basiert auf der Agglutination von Erythrozyten durch Immunserumantikörper gegen die Blutgruppenantigene A(II), B(III). Bei der Kontrolle handelt es sich um Serum, das keine Antikörper enthält, d. h. Serum-AB(IV)-Blutgruppe und Erythrozyten-Antigene der Gruppen A(P) und B(III). Rote Blutkörperchen der Gruppe 0(I) werden als Negativkontrolle verwendet, da sie keine Antigene aufweisen.

Zur Bestimmung des Rh-Faktors werden Anti-Rh-Seren verwendet (mindestens zwei verschiedene Serien). Befindet sich auf der Membran der untersuchten Erythrozyten ein Rh-Antigen, kommt es zur Agglutination dieser Zellen.

13.3. Niederschlagsreaktion

RP ist eine Immunreaktion der Wechselwirkung von Antikörpern mit Antigenen in Gegenwart von Elektrolyten, wobei sich das Antigen in einem löslichen Zustand befindet. Bei der Fällung werden lösliche Antigene durch Antikörper ausgefällt, was sich durch Trübungen in Form von Fällungsbanden äußert. Die Bildung eines sichtbaren Niederschlags wird beobachtet, wenn beide Reagenzien in äquivalenten Verhältnissen gemischt werden. Ein Überschuss an einem davon verringert die Anzahl der ausgefällten Immunkomplexe. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, die Fällungsreaktion durchzuführen.

Ringfällungsreaktion in Niederschlagsrohre mit kleinem Durchmesser gegeben. Das Immunserum wird in das Reagenzglas gegeben und das lösliche Antigen vorsichtig geschichtet. Bei einem positiven Ergebnis bildet sich an der Grenzfläche der beiden Lösungen ein milchiger Ring. Die Ringfällungsreaktion, die zur Bestimmung des Vorhandenseins von Antigenen in Organen und Geweben verwendet wird, deren Extrakte gekocht und filtriert werden, wird als Thermopräzipitationsreaktion (Ascoli-Reaktion zur Bestimmung thermostabiler Anthrax-Antigene) bezeichnet.

Ouchterlony-Doppelimmundiffusionsreaktion. Diese Reaktion wird in einem Agar-Gel durchgeführt. In einer gleichmäßig dicken Gelschicht werden in einem bestimmten Abstand zueinander Vertiefungen ausgeschnitten und mit Antigen bzw. Immunserum gefüllt. Danach diffundieren Antigene und Antikörper in das Gel, treffen aufeinander und bilden Immunkomplexe, die im Gel ausfallen und als Präzisionslinien sichtbar werden.

Ernährung. Mit dieser Reaktion lassen sich unbekannte Antigene oder Antikörper identifizieren, aber auch die Ähnlichkeit verschiedener Antigene testen: Bei identischen Antigenen verschmelzen die Präzipitationslinien, bei ungleichen Antigenen kreuzen sich die Präzipitationslinien, bei teilweise identischen Antigenen identisch, es entsteht ein Sporn.

Radiale Immundiffusionsreaktion. Dem geschmolzenen Agargel werden Antikörper zugesetzt und das Gel wird in einer gleichmäßigen Schicht auf das Glas aufgetragen. In das Gel werden Vertiefungen ausgeschnitten und mit einem Standardvolumen an Antigenlösungen unterschiedlicher Konzentration versetzt. Während der Inkubation diffundieren Antigene radial aus der Vertiefung und bilden beim Zusammentreffen mit Antikörpern einen Niederschlagsring. Solange überschüssiges Antigen in der Vertiefung verbleibt, kommt es zu einer allmählichen Vergrößerung des Durchmessers des Niederschlagsrings. Diese Methode dient zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in der Testlösung (z. B. zur Bestimmung der Konzentration von Immunglobulinen verschiedener Klassen im Blutserum).

Immunelektrophorese. Das Antigengemisch wird zunächst elektrophoretisch getrennt, dann wird präzipitierendes Antiserum in die Rille gegeben, die entlang der Proteinbewegungsrichtung verläuft.

Antigene und Antikörper diffundieren im Gel aufeinander zu; Durch ihre Wechselwirkung bilden sie bogenförmige Niederschlagslinien. Flockungsreaktion

(nach Ramon) – eine Art Fällungsreaktion, die zur Bestimmung der Aktivität von antitoxischem Serum oder Toxoid verwendet wird. Die Reaktion wird in Reagenzgläsern durchgeführt. In einem Reagenzglas, in dem Toxoid und Antitoxin in einem äquivalenten Verhältnis vorliegen, wird eine Trübung beobachtet.

13.4. Komplementfixierungsreaktion

Antikörper, die mit dem entsprechenden Antigen interagieren, binden das hinzugefügte Komplement (1. System). Ein Indikator für die Komplementfixierung sind mit hämolytischem Serum sensibilisierte Erythrozyten, d. h. Antikörper gegen rote Blutkörperchen (2. System). Wenn das Komplement im 1. System nicht festgelegt ist, d. h. Kommt es nicht zur Antigen-Antikörper-Reaktion, werden die sensibilisierten roten Blutkörperchen vollständig lysiert (negative Reaktion). Bei der Komplementfixierung durch Immunkomplexe des 1. Systems kommt es nach Zugabe sensibilisierter Erythrozyten zu einer Hämolyse

abwesend (positive Reaktion). Die Komplementfixierungsreaktion wird zur Diagnose von Infektionskrankheiten (Tripper, Syphilis, Influenza usw.) verwendet.

Mikroben und ihre Toxine wirken sich schädigend auf die Organe und Gewebe des menschlichen Körpers aus. Antikörper sind in der Lage, sich an diese Schadstoffe zu binden und sie zu blockieren, d. h. neutralisieren. Die diagnostische Neutralisationsreaktion basiert auf dieser Eigenschaft von Antikörpern. Sie erfolgt durch Einbringen eines Antigen-Antikörper-Gemisches in Tiere oder in empfindliche Testobjekte (Zellkultur, Embryonen). Um beispielsweise Giftstoffe im Material eines Patienten nachzuweisen, wird Tieren der 1. Gruppe Material des Patienten injiziert. Den Tieren der 2. Gruppe wird ein ähnliches Material injiziert, das mit dem entsprechenden Antiserum vorbehandelt wurde. Tiere der 1. Gruppe sterben, wenn sich im Material ein Gift befindet. Die zweite Tiergruppe überlebt; die schädigende Wirkung des Toxins zeigt sich nicht, da es neutralisiert wird.

13.6. Reaktionen mit markierten Antikörpern oder Antigenen

13.6.1. Immunfluoreszenzreaktion (RIF, Koons-Methode)

Diese Methode dient der Expressdiagnostik. Damit können sowohl mikrobielle Antigene als auch Antikörper nachgewiesen werden.

Direkte RIF-Methode- eine Immunreaktion der Wechselwirkung von Antikörpern mit Antigenen, und die Antikörper werden mit einem Fluorochrom markiert – einer Substanz, die in der Lage ist, Lichtquanten einer bestimmten Wellenlänge zu emittieren, wenn sie Licht einer bestimmten Wellenlänge ausgesetzt wird. Die Besonderheit dieser Methode besteht in der Notwendigkeit, nicht umgesetzte Komponenten zu entfernen, um den Nachweis unspezifischer Lumineszenz auszuschließen. Waschen Sie dazu nicht reagierte Antikörper ab. Die Ergebnisse werden mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Bakterien in einem mit einem solchen Lumineszenzserum behandelten Abstrich leuchten vor einem dunklen Hintergrund entlang der Zellperipherie.

Indirekte RIF-Methode wird häufiger verwendet als das vorherige. Diese Reaktion wird in zwei Stufen durchgeführt. Im ersten Stadium interagieren Antigene

interagieren mit den entsprechenden Antikörpern und bilden Immunkomplexe. Alle Komponenten, die nicht reagiert haben (d. h. nicht Teil von Immunkomplexen sind), müssen durch Waschen entfernt werden. Im zweiten Schritt wird der resultierende Antigen-Antikörper-Komplex mit fluorchromatiertem Antiglobulin-Serum nachgewiesen. Dadurch entsteht ein Komplex aus Mikroben + antimikrobiellen Kaninchen-Antikörpern + Antikörpern gegen Kaninchen-Immunglobuline, markiert mit Fluorochrom. Die Ergebnisse werden mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.

13.6.2. Enzymimmunoassay-Methode oder -Assay

ELISA – am häufigsten moderne Methode, zur Diagnose viraler, bakterieller und protozoischer Infektionen, insbesondere zur Diagnose von HIV-Infektionen, Virushepatitis usw.

Es gibt viele ELISA-Modifikationen. Der nichtkompetitive Festphasen-ELISA ist weit verbreitet. Die Durchführung erfolgt in 96-Well-Polystyrolplatten (Festphase). Bei der Durchführung einer Reaktion ist es in jedem Schritt erforderlich, nicht umgesetzte Bestandteile abzuwaschen. Bei der Bestimmung von Antikörpern wird das Testblutserum in die Vertiefungen gegeben, in denen Antigene sorbiert werden, und anschließend mit einem Enzym markiertes Antiglobulinserum. Die Reaktion wird durch Zugabe eines Substrats für das Enzym durchgeführt. In Gegenwart eines Enzyms verändert sich das Substrat und der Enzym-Substrat-Komplex wird so ausgewählt, dass das bei der Reaktion gebildete Produkt gefärbt wird. Bei einer positiven Reaktion wird somit eine Farbänderung der Lösung beobachtet. Zur Bestimmung von Antigenen wird der Festphasenträger mit Antikörpern sensibilisiert, dann werden nacheinander das Testmaterial (Antigene) und das mit Enzymen markierte Serum zu den Antigenen hinzugefügt. Damit die Reaktion stattfinden kann, wird ein Substrat für das Enzym hinzugefügt. Bei einer positiven Reaktion kommt es zu einer Farbveränderung der Lösung.

13.6.3. Immunblotting

Diese Methode basiert auf einer Kombination aus Elektrophorese und ELISA. Bei der Durchführung von Immunblotting (Blotting aus dem Englischen). Fleck- Spot) wird zunächst eine komplexe Antigenmischung einer Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel unterzogen. Das resultierende fraktionierte Anti-

Genpeptide werden auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Anschließend werden die Blots mit enzymmarkierten Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen behandelt, d. h. Führen Sie einen ELISA-Blot durch. Immunblotting wird bei der Diagnose von Infektionen wie HIV eingesetzt.

13.6.4. Immunelektronenmikroskopie

Bei der Methode werden Viren (seltener andere Mikroben) in einem Elektronenmikroskop mikroskopiert und mit dem entsprechenden Immunserum vorbehandelt, das mit elektronenoptisch dichten Präparaten markiert ist, beispielsweise Ferritin, einem eisenhaltigen Protein.

13.7. Durchflusszytometrie

Die Differenzierung der Blutzellen erfolgt mittels Laserzytofluormetrie. Dazu werden die gewünschten Zellen mit fluoreszierenden monoklonalen Antikörpern gegen CD-Antigene angefärbt. Die Blutprobe wird nach der Behandlung mit markierten Antikörpern durch ein dünnes Röhrchen geleitet und mit einem Laserstrahl durchströmt, der das Fluorochrom zum Leuchten anregt. Die Fluoreszenzintensität korreliert mit der Dichte der Antigene auf der Zelloberfläche und kann mit einem Photomultiplier-Röhrchen quantitativ gemessen werden. Die erhaltenen Ergebnisse werden in ein Histogramm umgewandelt.

Die Durchflusszytometrie dient zur Bestimmung des Immunstatus (Gehalt der Hauptpopulationen von Lymphozyten, Gehalt an intrazellulären und extrazellulären Zytokinen, funktionelle Aktivität von NK-Zellen, Phagozytoseaktivität usw.).