по применению «Набора реагентов для определения антигенов и антител системы Резус крови человека»
(АГС для пробы Кумбса)
ТУ 9398-102-51203590-2012
РУ № РЗН 2013/1255 от 11.10.2013
I. ВВЕДЕНИЕ
Стандартная сыворотка для пробы Кумбса содержит специфические гетероиммунные антитела против белка крови человека и предназначена для использования в двух вариантах реакции – прямой и непрямой пробе Кумбса.
Прямая проба Кумбса применяется для определения сенсибилизации эритроцитов in vivo при гемолитической болезни новорожденнных и у больных с аутоиммунной формой хронической гемолитической анемии а также при некоторых других состояниях. Проведение прямой пробы Кумбса заключается в том, что к исследуемым эритроцитам, предварительно отмытым от белков собственной плазмы, добавляется сыворотка для пробы Кумбса. Если эритроциты были сенсибилизированы in vivo, то в результате реакции происходит их агглютинация.
Непрямая проба Кумбса применяется как проба для выявления состояния сенсибилизации организма, позволяющая выявлять антитела, находящиеся в свободном состоянии в сыворотке крови исследуемого лица; как проба на совместимость переливаемой крови, когда исследуется воздействие сыворотки реципиента на эритроциты предполагаемого донора; и как проба для определения различных групповых антигенов в эритроцитах при помощи предварительного воздействия на них стандартных сывороток, содержащих антитела заведомо известной специфичности. Непрямая проба Кумбса (все варианты) производится в два этапа, первым из которых является инкубация исследуемой (или стандартной) сыворотки со стандартными (или исследуемыми) эритроцитами, т. е. сенсибизация эритроцитов in vitro. Второй этап – собственно реакция с сывороткой для пробы Кумбса, которая производится так же, как прямая проба Кумбса.
Конечный результат реакции как в прямой, так и в непрямой пробе Кумбса происходит за счет взаимодействия стандартной сыворотки для пробы Кумбса, с антителами (белком крови человека), фиксированными на эритроцитах. Этот результат проявляется в виде агглютинации эритроцитов. Для наблюдения за агглютинацией следует использовать белую фарфоровую или любую белую пластинку обязательно со смачиваемой поверхностью для того, чтобы наносимые на нее капли хорошо размешивались и не растекались по поверхности пластинки. Перемешанные капли следует слегка размазать по пластинке, приблизительно до размера 2-х копеечной монеты.
II. ПОДГОТОВКА ИНГРЕДИЕНТОВ РЕАКЦИИ
Исследуемую сыворотку для определения в ней наличия и специфичности антител получают из крови обследуемого лица без добавления консерванта. Хранят при температуре + 4–8 0 С не более 2 суток или в замороженном состоянии – срок 1 месяц.
Сыворотку для пробы на совместимость получают таким же способом, но используют со сроком хранения не более 2 суток.
Эритроциты, предназначенные для определения в них тех или иных изоантигенов, заготавливаются с каким-либо консервантом от лица, кровь которого исследуется. Можно также использовать осадок эритроцитов из крови, взятой без консерванта.
При пробе на совместимость используется кровь донора, спущенная через иглу из флакона, приготовленного для переливания.
Во всех случаях эритроциты 3-4 раза отмываются в пробирках от плазмы, путем добавления к одному объему эритроцитов 8-10 объемов изотонического раствора хлорида натрия, с последующим перемешиванием и центрифугированием при 1500-2000 об/мин в течение 5-10 мин (до полного осаждения эритроцитов). После каждого центрифугирования надстой отсасывается.
III. ТЕХНИКА ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИЙ
Испытуемые эритроциты готовят в виде 5% взвеси, для чего одну каплю четырежды отмытых эритроцитов смешивают в пробирке с 19 каплями изотонического раствора хлорида натрия.
Одну каплю (0,05 мл) 5% взвеси эритроцитов переносят на белую пластинку и размазывают. Пластинку покачивают и в течение 3-х минут наблюдают, не наступила ли агглютинация эритроцитов. Если агглютинация не наступила, то сюда же добавляют 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса, капли тщательно перемешивают, после чего пластинку слегка покачивают, затем на одну-две минуты оставляют в покое и снова покачивают. Одновременно в течение 10 минут ведут наблюдение за результатом, который выражается в наличии или отсутствии агглютинации.
Трактовка результатов прямой пробы Кумбса.
Отсутствие агглютинации – отрицательная проба
Наличие агглютинации
– положительная проба, что указывает на сенсибилизацию исследуемых эритроцитов, т. е. на абсорбцию на них антител, происшедшую in vivo в организме человека (новорожденного, больного). Если агглютинация исследуемых эритроцитов наступила до добавления
к ним сыворотки для пробы Кумбса, результат прямой пробы не учитывается.
2. Непрямая проба Кумбса
Предназначенная для выявления изоантител в сыворотке крови обследуемого лица
Применяется в тех случаях, когда необходимо выяснить, содержатся ли в крови больного, беременной женщины, донора и т. д. изоиммунные антитела неполной формы и установить их специфичность. Для реакции используют сыворотку крови обследуемого лица и стандартные эритроциты заведомо известной специфичности. Среди этих 8-10 или более образцов эритроцитов должны быть различия по факторам других систем и очень важно, чтобы каждый из этих факторов содержался хоты бы в одном образце эритроцитов. Также в панель включаются образцы резус-отрицательных эритроцитов с различными сочетаниями антигенов других систем, так, чтобы среди них имелись Даффи-положительные и Даффи-отрицательные, которые, в свою очередь, делились бы на Келл-положительные и Келл-отрицательные, Кидд-положительные и Кидд-отрицательные и т. д. В качестве отрицательного контроля в реакцию по возможности включают эритроциты того лица, сыворотка которого исследуется.
Техника реакции
В штатив устанавливают ряд центрифужных или других пробирок объемом 3-10 мл, по числу образцов эритроцитов, включенных в реакцию. Пробирки маркируют и, согласно маркировке, вносят в них по 1 маленькой капле (0,01 мл) отмытых стандартных эритроцитов. В каждую пробирку накапывают три капли исследуемой сыворотки, пробирки сильно встряхивают для перемешивания эритроцитов с сывороткой и помещают в термостат при 37 0 С на 45 мин. После инкубации пробирки вынимают из термостата, и эритроциты отмывают путем добавления до верха пробирки изотонического раствора хлорида натрия, перемешивания и последующего центрифугирования. Отмывание повторяют 3-4 раза, каждый раз тщательно отсасывая надстой, затем к отмытым эритроцитам добавляют 2 капли изотонического раствора хлорида натрия для получения приблизительно 5% взвеси (при использовании центрифужных пробирок можно ограничиться двухкратным отмыванием).1 каплю 5% взвеси эритроцитов из каждой пробирки переносят на белую пластинку, добавляют туда 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса и тщательно перемешивают сыворотку с эритроцитами. Пластинку слегка покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают, одновременно наблюдая за результатом реакции в течение 20 минут.
Трактовка результатов
Отсутствие признаков агглютинации (отрицательный результат) во всех образцах значит, что в исследуемой сыворотке не содержится неполных антител к групповым антигенам, которые содержатся в стандартных эритроцитах, включенных в исследование.Если в некоторых или в большинстве капель, кроме контроля, наблюдается агглютинация , это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся неполные антитела против антигенов эритроцитов. Вопрос о специфичности этих антител решается по сопоставлению положительных и отрицательных реакций с антигенной структурой эритроцитов, включенных в реакцию. Вопрос об активности этих антител решается титрованием.
Пример 1. Агглютинация имела место со всеми образцами эритроцитов, содержащими фактор Rh 0 (D), независимо от наличия и от отсутствия других факторов этой системы и других систем, в то время, как со всеми Rh 0 (D) – отрицательными образцами агглютинации не наблюдалось (так же независимо от наличия или отсутствия других факторов) – это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся неполные антитела анти-резус – Rh 0 (D).
Пример 2 . Агглютинация имела место со всеми образцами эритроцитов, содержацими фактор Даффи, независимо от наличия или отсутствия антигенов системы резус и других систем, в то время, как со всеми Даффи-отрицательными образцами агглютинации не наблюдалось, это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся неполные антитела анти-Даффи.
Дополнение. В случае, если в учреждении не имеется полной панели стандартных эритроцитов, но есть необходимость в исследовании сыворотки на наличие антител, рекомендуется провести исследование с 25-30 произвольно взятыми образцами эритроцитов здоровых лиц группы 0 (I) или одноименной с исследуемой сывороткой. Это даст возможность решить вопрос о наличии или отсутствии антител к большинству антигенов системы Rh-Hr, Даффи, Келл, Кидд.
При получении положительного результата дальнейшее заключение о специфичности выявленных антител может быть решено при специальном исследовании с полной панелью стандартных эритроцитов.
3. Техника проведения непрямой пробы Кумбса, как пробы на совместимость переливаемой крови
Для предупреждения несовместимости при переливании крови, перед трансфузией обязательно должны быть произведены следующие пробы на совместимость:
Проба на совместимость по группам крови АВО, которая производится на плоскости при комнатной температуре.
Пробы на совместимость по резус-фактору и другим изоантигенам.
Одну маленькую (0,01 мл) каплю отмытых эритроцитов донора, взятых через иглу из флакона с кровью, предназначенной для переливания, переносят на дно центрифужной или другой пробирки объемом 3-4 мл и добавляют в нее 3 капли сыворотки больного. Пробирку встряхивают для перемешивания эритроцитов с сывороткой, после чего помещают в термостат при 37 0 С на 45 мин. После инкубации добавляют в пробирку доверху изотонический раствор хлорида натрия, содержимое пробирки перемешивают и центрифугируют 5-10 мин. Такое отмывание эритроцитов повторяют 3 раза, каждый раз тщательно удаляя надстой. При использовании центрифужных пробирок можно ограничиться двухкратным отмыванием. К отмытым эритроцитам добавляют 2 капли изотонического раствора хлорида натрия для получения приблизительно 5% взвеси.
1 каплю 5% взвеси эритроцитов переносят на белую пластинку, добавляют туда 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса и тщательно перемешивают сыворотку с эритроцитами. Затем пластинку слегка покачивают, на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают, одновременно наблюдая результат в течение 20 минут.
Примечание:
При несовместимости по резус-фактору агглютинация обычно наступает в течение первой минуты, однако при низком титре резус-антител (или других антител) агглютинация может наступить позже, иногда к двадцатой минуте.
Трактовка результата:
Агглютинаты видны в виде комочков на просветленном или полностью обесцвеченном фоне – это значит, что кровь донора несовместима с кровью реципиента и не может быть ему перелита.
Отсутствие признаков агглютинации означает, что кровь больного не содержит неполных антител к эритроцитам донора в отношении резус-фактора и других изоантигенов, к которым могли образоваться антитела неполной формы.
Непрямая проба Кумбса является чувствительной только в отношении неполных антител.
4. Техника непрямой проба Кумбса для определения антигенной структуры эритроцитов
Данная проба используется для определения наличия или отсутствия какого-либо группового антигена эритроцитов при помощи стандартной сыворотки, содержащей соответствующие антитела в неполной форме.
Наиболее часто непрямая проба Кумбса используется при определении антигенов Келл (К), Даффи (Fy), Кидд (Jk), и также для определения слабого антигена системы резус (Du).
Прежде, чем приступить к определению антигенов, исследуемые эритроциты следует проверить в прямой пробе Кумбса. При положительном результате прямой пробы – определение антигенов непрямой пробой Кумбса провести нельзя и для этой цели нужно применить другие реакции.
Для реакции используют центрифужние или другие пробирки объемом 3-4 мл в количестве трех: одну – для исследуемого образца эритроцитов и две для На дно первой пробирки вносят 1 маленькую (0,01 мл) каплю трижды отмытых испытуемых эритроцитов, во вторую - контрольные эритроциты, содержащие искомый антиген (например, Даффи- положительные) и в третью пробирку – отрицательный контроль (Даффи – отрицательные). Во все пробирки добавляют по 2-3 капли стандартной сыворотки (в данном примере анти-Даффи). Пробирки встряхивают для перемешивания содержимого и помещают в термостат при 37 0 С на 45 мин. После такой инкубации пробирки вынимают из термостата, доливают в них доверху изотонический раствор хлорида натрия, тщательно перемешивают содержимое и центрифугируют при1500-2000 тыс. об/мин в течение 5-10 мин. После центрифугирования надстой тщательно отсасывают и такое отмывание эритроцитов повторяют 4 раза. (При использовании центрифужных пробирок можно ограничиться двухкратным отмыванием).
К отмытым эритроцитам добавляют 2 капли изотонического раствора хлорида натрия для получения приблизительно 5% взвеси. 1 каплю 5% взвеси эритроцитов из каждой пробирки переносят на белую пластинку, к каждой капле эритроцитов добавляют 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса и перемешивают. Пластинку слегка покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают, одновременно наблюдая за ходом реакции в течение 20 минут.
Трактовка результатов
Наличие агглютинации эритроцитов (положительный результат) означает, что кровь содержит искомый антиген (в данном примере – кровь Даффи-положительная).
Отсутствие агглютинаци (отрицательный результат) означает, что исследуемая кровь не содержит искомого антигена (Даффи-отрицательная).
Результат учитывается как истиный после проверки контрольных образцов, т. е. в примере при положительном результате с Даффи-положительным образцом и отрицательном – с Даффи-отрицательным образцом.
5. Форма выпуска
Реактив выпускается в жидкой форме во флаконах объемом 5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве консерванта применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1%.
6.Хранение
Срок хранения - два года в холодильнике при 2-8°С. Вскрытый флакон годен к использованию при хранении в холодильнике в герметично закрытом виде в течение всего срока годности.
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности, неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев, истекший срок годности реагента. При составлении рекламации просим указать дату получения, поставщика (если Вы получили товар не от производителя), номер серии, причины, по которым реагент признан негодным. Просим приложить протокол с результатами проверки реагента и 2-3 невскрытых флакона с реактивом
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель ООО «МЕДИКЛОН»: 127276
Или растворенных в плазме.
Синонимы: антиглобулиновый тест, Coombs test, AGT, indirect/direct antiglobuline test, IAT, NAT, DAT, indirect/direct Coombs test
Проба Кумбса – это
анализ, с помощью которого выявляют иммунизированность и антитела к эритроцитам.
Виды пробы Кумбса
- прямая проба Кумбса – определяет антитела зафиксированные на поверхности эритроцитов. Проводится при подозрении на аутоиммунную гемолитическую анемию , гемолиз при аутоиммунных заболеваниях, после приема лекарств (метилдопа, пенициллин, хинин), после переливания крови и гемолитической болезни новорожденных .
Эритроциты были сенсибилизированы in vivo – к ним уже прочно прикреплены антитела, а добавление антиглобулиновой сыворотки (анти-IgG) вызывает склеивание сенсибилизированных клеток, что и видно невооруженным глазом.
- непрямая проба Кумбса – выявляет антиэритроцитарные антитела в плазме крови, выполняют перед переливанием крови и при беременности .
Антиэритроцитарные антитела - разновидность аутоантител, т.е. антител против собственных же тканей. Аутоантитело возникает при патологической реактивности иммунной системы на некоторые препараты, например, на высокие дозы пенициллина.
Эритроциты на своей поверхности содержат различные химические структуры (гликолипиды, сахариды, гликопротеины и протеины), в медицине именуемые антигенами . Человек наследует от родителей определенную карту антигенов на каждой красной клетке крови.
Антигены объединены в группы и подле этого кровь делят на несколько групп - по системе AB0, резус, Келл, Левис, Кидд, Даффи . Самые известные и значимые в работе врача - AB0 и резус-фактор (Rh).
Система AB0
Резус-принадлежность человека определяется наличием именно этих антигенов. Особо важный антиген эритроцитов – антиген D. Если он присутствует, то говорят о резус-положительной крови RhD, а если его нет – о резус-отрицательной Rhd.
Если к антигенам эритроцитов присоединится соответствующее антитело, то эритроцит разрушается – гемолизирует .
Показания к проведению прямого антиглобулинового теста
- первичная аутоиммунная гемолитическая анемия
- гемолитическая анемия при аутоиммунных, опухолевых, инфекционных заболеваниях
- лекарственная аутоиммунная гемолитическая анемия
- посттрансфузионная гемолитическая анемия (дни - месяцы)
- гемолитическая болезнь новорожденного (несовместимость по одной из групп крови)
Показания к проведению непрямого антиглобулинового теста
- перед переливанием крови
- при беременности резус-отрицательной женщины
Аутоиммунная гемолитическая анемия
Аутоиммунная гемолитическая анемия (первичная) – классическое аутоиммунное заболевание с неизвестными причинами. Предполагают нарушение в процессе взаимодействия на уровне иммунной системы, что ведет к восприятию собственных эритроцитов как чужих. Клетки продуцируют антитела класса IgG (реагируют при t 37°C) и/или IgM (при t 40°C), присоединяясь к поверхности эритроцита запускают ряд ферментов (систему комплемента) и «продырявливают» стенку эритроцита, что приводит к его разрушению – гемолизу .
Симптомы гемолитической анемии
- усталость, общая слабость, раздражительность
- одышка
- боль в животе, тошнота
- темный цвет мочи
- боли в спине
- желтушное окрашивание кожи и слизистых оболочек
- увеличение печени, селезенки
- снижение количества эритроцитов и гемоглобина в общем анализе крови
Положительный результат прямой пробы Кумбса на 100% подтверждает диагноз аутоиммунной гемолитической анемии, доказывая ее аутоммунное происхождение. Одновременно отрицательный результат - не дает возможностиснять диагноз.
Вторичная аутоиммунная гемолитическая анемия и положительная проба Кумбса могут быть при следующих заболеваниях:
- системная красная волчанка
- синдром Эванса
- макроглобулинемия Вальденстрема
- пароксизмальная холодовая гемоглобинурия
- хронический лимфолейкоз
- лимфомы
- инфекционный мононуклеоз
- инфицирование микоплазмой пневмонии
- сифилис
Положительность антиглобулинового теста при данных заболеваниях не служит диагностическим критерием, а является одним из симптомов заболевания.
Гемолитическая болезнь новорожденного
Причина гемолитической болезни новорожденных - несовместимостьгрупп крови у матери и плода, в большинстве случаев по системе резус, в одиночных - по системе АВ0, казуистично - по другим антигенам.
Резус-конфликт развивается, если у резус-отрицательной женщины плод унаследовал от отца резус-положительную кровь.
Заболевание у новорожденного развивается только в том случае, если мать уже выработала антитела к соответствующим антигенам, что бывает после предыдущих беременностей, родов , абортов, переливания несовместимой крови. Наиболее частая причина запуска синтеза антител к антигенам эритроцитарной оболочки - роды (фето-материнское кровотечение). Первые роды в основном проходят без осложнений, но вот последующие - чреваты гемолитической болезнью новорожденного в первые дни после рождения.
Симптомы гемолитической болезни новорожденного
- желтушность кожи
- анемия
- бледность кожи и слизистых
- увеличение печени и селезенки
- нарушения дыхания
- отек всего тела
- возбуждение и постепенное угнетение центральной нервной системы
Анемия после переливания крови
Непрямую пробу Кумбса проводят перед переливанием крови для оценки совместимости, а прямую пробу Кумбса - после него при подозрении на посттрансфузный гемолиз, т.е. при наличии симптомов, таких как лихорадка, озноб, поливость (читай ниже). Цель анализа – выявить антитела к перелитым эритроцитам, которые связались с эритроцитами получившего кровь и являются причиной посттрансфузного гемолиза, а также преждевременного удаления донорских эритроцитов из кровообращения у реципиента (того, кто получил кровь).
Симптомы гемолитической реакции после переливания крови
- повышение температуры тела
- сыпь на коже
- боли в спине
- красная окраска мочи
- тошнота
- головокружение
Расшифровка пробы Кумбса
Стоит напомнить, что принципиальные правила расшифровки прямого и непрямого антиглобулинового теста одинаковы. Единственное отличие - расположение антител - в крови или уже на красной клетке крови - на эритроците.
- если прямая проба Кумбса отрицательна – это значит что на эритроцитах не «сидит» антитело и причину симптомов нужно искать дальше и провести непрямую пробу Кумбса
- если положительный результат пробы Кумбса выявлен после переливания крови, инфекций, лекарств – положительность может длится до 3 месяцев (время жизни эритроцитов 120 дней - 3 месяца)
- положительный результат антиглобулинового теста при аутоиммунном заболевании может длится месяцы и даже годы
Нормы пробы Кумбса
- прямая проба Кумбса - отрицательно
- непрямая проба Кумбса - отрицательно
Качественно положительный результат измеряется в количестве плюсов от одного до четырех (+, ++, +++, ++++), а количественно в цифровом виде - 1:16, 1:256 и т.д.
4 факта о пробе Кумбса
- предложена впервые в Кэмбридже в 1945 году
- порог чувствительности - не менее 300 фиксированных молекул антител на одном эритроците
- число антител запускающих гемолиз - индивидуально для каждого человека (от 16-30 до 300)
- динамика других лабораторных показателей гемолитической анемии (гемоглобин, билирубин, ретикулоциты) может нормализоваться, а проба Кумбса останется на том же уровне
Недостатки антиглобулинового теста
- нельзя определить силу связывания антигена с антителом
- неизвестно количество связанных антител
- не определяет вид антитела
- положительность пробы Кумбса не поможет определить ее причину
- 0,5% здоровых людей имеют положительную пробу Кумбса без каких-либо признаков гемолитической анемии
- не подходит для контроля успешности лечения, поскольку не укажет активность гемолиза эритроцитов
На поверхности эритроцитов находится большое количество антигенов. В зависимости от вида этих антигенов выделяют группы крови, самые изученные группы - АВО, Rh, Kell, Duffy и мн...
Средняя цена в вашем регионе: 2645 от 2645 … до 2645
1 лабораторий делают данный анализ в вашем регионе
Описание исследования
Подготовка к исследованию: Кровь берут из вены, а затем получают сыворотку (плазма крови без фибриногена) путем естесственного свертывания или путем осаждения фибриногена. Исследуемый материал: Взятие крови
На поверхности эритроцитов находится большое количество антигенов. В зависимости от вида этих антигенов выделяют группы крови, самые изученные группы - АВО, Rh, Kell, Duffy и многи другие системы. В норме в крови существуют антитела к антигенам другой группы, но при переливании крови, беременности, аутоиммунных заболеваниях и др. обнаруживаются антитела к своим антигенам.Неполные антитела к эритроцитам
Метод
Непрямая реакция Кумбса основана на выявлении агглютинации (слипания) эритроцитов, у которых на поверхности имеются неполные антитела, которая появляется при добавлении антиглобулиновой сыворотки.
На первом этапе в одну пробирку вносят донорские эритроциты (O(I) группа, Rh+) и исследуемую сыворотку. Если неполные антитела к эритроцитам присутствуют в исследуемой сыворотке, то они фиксируются на поверхности донорских эритроцитов.
На втором этапе на стекло наносят донорские эритроциты с антителами (если они были) и стандартную антиглобулиновую сыворотку с антителами к человеческим иммуноглобулинам. Если на первом этапе антитела к эритроцитам зафиксировались на поверхности эритроцитов, то при добавлении стандартной сыворотки эритроциты склеиваются из-за взаимодействие антител.
Референсные значения - норма
(Реакция Кумбса непрямая (антиглобулиновый тест, выявление неполных антиэритроцитарных антител), кровь)
Информация, касающаяся референсных значений показателей, а также сам состав входящих в анализ показателей может несколько отличаться в зависимости от лаборатории!
Норма:
В норме антител к собственным эритроцитам не должно быть, при постановке реакции Кумбса агрегации эритроцитов не происходит.
Показания
Исследование гуморального специфического иммунитета при подозрении на аутоиммунные реакции в организме, резус-конфликт между матерью и плодом, определение совместимости крови донора и реципиента
Повышение значений (положительный результат)
Антитела к эритроцитам обнаруживают при:
1. Аутоиммунных гемолитических анемиях
2. Гемолитической болезни новорожденных
3. Системных заболеваниях соединительной ткани
4. Хроническом активном гепатите и др.
Принцип антиглобулинового . Антиэритроцитные антитела неполного типа и молекулы комплемента (С), находящиеся на поверхности эритроцитов выявимы - прямой тест - их агглютинацией в контакте с животной сывороткой, содержащей антитела на человеческий антиглобулин (антиглобулиновая сыворотка). Свободные в сыворотке неполные антитела выявляются - косвенный тест - их закреплением на смеси нормальных эритроцитов группы 0, все антигены которых принадлежат известной резус-системе, далее агглютинируемые под воздействием антиглобулиновой сыворотки.
Материалы, реагенты антиглобулинового теста Кумбса : пробирки на 10/100 мл; градуированные пипетки на 1, 2 мл; пастеровские пипетки; штативы; предметные нешлифованные стекла; 8,5‰ раствор NaCl; эритроциты. Эритроциты больного, равно как и принадлежащие к группе 0 получим из свежеотобранной крови на противосвертывающем веществе (раствор ЭДТА).
Эритроциты группы 0 отобрать с таким расчетом, чтобы они исходили от лиц в норме и содержали все антигены резус-системы . Их можно сохранять до 7 дней в аутологической плазме, при температуре + 4°С. В случае отсутствия эритроцитов группы 0, известной антигенной мозаики, можно использовать смесь эритроцитов группы 0, резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов.
Сыворотка больного должна быть свежеотобранной.
Антиглобулиновая сыворотка производится институтом им. д-ра И. Кантакузино, выпускается в лиофилизированном виде в содержащих 1 мл ампулах. После растворения сыворотку хранить при температуре -20°С.
Техника антиглобулинового теста Кумбса
:
а) Прямой тест Кумбса
: эритроциты больного промыть 3 раза 8,5‰ раствором NaCl.
На несколько предметных стекол нанести по крупной капле из разведений антиглобулиновой сыворотки, а рядом - по маленькой капле из осадка эритроцитов больного; перемешать капли углом стекла. Приготовленный материал оставить на столе 5 мин., затем исследовать на наличие агглютинатов. В случае положительного результата определить максимальный агглютинирующий титр.
б) Косвенный тест Кумбса : эритроциты группы 0, резусположительные и резус-отрицательные промыть 3 раза 8,5‰ раствором NaCl и подвергнуть воздействию сыворотки больного из расчета 2 капли эритроцитов на 8-10 капель сыворотки, затем, в течение 60 мин., провести инкубацию при температуре 37°С. После этого снова трижды промыть эритроциты и воздействовать на них антиглобулиновой сывороткой, по указаниям для прямого теста Кумбса.
Когда речь идет о холодовых активных антителах сенсибилизацию эритроцитов группы 0 провести 60 мин. при температуре + 4°С.
Примечание : 1) Не проводить прямой тест Кумбса на эритроцитах, сохраненных один или несколько дней при температуре + 4°С или комнатной температуре, поскольку результаты могут оказаться ложноположительными за счет фиксации имеющихся в нормальной сыворотке непол ных, активных на холоде антител. 2) В случаях выраженной гиперпротеинемии промывать эритроциты 4-5 раз и проверить отсутствие сывороточных белков в последней промывной жидкости, с помощью сулфосалициловой кислоты.
Возможный остаток 2 мкг IgG/мл в эритроцитном осадке может нейтрализовать антиглобулиновую сыворотку . Тест Кумбса можно проводить и с помощью моноспецифических анти-IgG, -IgM, -IgA -С3 и -С4 сывороток в целях уточнения вида, находящихся на поверхности эритроцитов глуболин, например, у страдающих аутоиммунной гемолитической анемией.
– исследование, которое помогает определить содержание неполных антиэритроцитарных антител в крови. Такой антиглобулиновый тест позволяет выявить антитела к у беременных женщин.
Кроме того, он позволяет на начальных стадиях диагностировать гемолитическую анемию у новорожденных детей с резус-конфликтом. Это помогает предотвратить разрушение эритроцитов, необходимых для нормального кроветворения. Данный тест был создан в 1945 году Робертом Кумбсом, из-за чего и получил такое название.
Проба Кумбса – разностороннее исследование, позволяющее своевременно диагностировать нарушения в кроветворении как у взрослых, так и детей.
Существуют следующие виды таких тестов:
- Прямая проба Кумбса – позволяет определить антитела, располагающиеся на поверхности эритроцитов. Обычно такое исследование назначается при подозрении на гемолиз, аутоиммунную гемолитическую анемию, другие аутоиммунные заболевания. Кроме того, оно проводится после медикаментозной терапии препаратами на основе хинина, пенициллина или метилдопа или же после переливания крови. Для получения более точных результатов перед исследованием необходимо полностью отказаться от приема лекарств хотя бы за 1 неделю.
- Непрямая проба Кумбса – тест, с помощью которого можно выявить антиэритроцитарные антитела в плазме. Обычно его проводят при беременности и перед переливанием крови. Антиэритроцитарные антитела появляются в крови человека при реактивной работе иммунитета или же как реакция на некоторые лекарственные средства. Для более точного изучения проводится сразу несколько заборов с интервалом в 2 часа.
Показания к проведению
Проба Кумбса проводится только при наличии серьезных показаний. Это дорогостоящее и длительное исследование, которое является специфическим тестом.
Обычно показаниями для его проведения считаются следующие ситуации:
- При переливании крови . Тест позволяет определить, приживется ли кровь реципиента в организме человека, а также возможно ли донорство. В таком случае необходимо исследовать материал как донора, так и реципиента. Важно определить характер антител, ведь в случае их несовместимости в организме на фоне резус-конфликта разрушается иммунная система. Это приводит к развитию серьезных заболеваний, а в редких случаях даже смерти.
- Перед хирургическими вмешательствами, когда существует риск кровопотери . Это делается для того, чтобы врач смог моментально ввести подходящую кровь для восстановления организма.
- Для выявления резус-сенсибилизации. Резус – специфический антиген, который возникает в организме каждой женщины во время беременности. Если же у матери положительный резус, а у отца отрицательный, или же наоборот, зависимости для ребенка нет – он может унаследовать любой. Если же ребенок получает противоположный материнскому резус, велик риск сенсибилизации. Это явление характеризуется смешением крови матери и ребенка. Это может произойти как во время вынашивания плода, так и в процессе рождения.
Если в организме беременной женщины возникает резус-конфликт, то иммунитет матери начинает воспринимать свой плод как инородное тело. Из-за этого велик риск того, что он начнет его атаковать.
В результате таких действий у малыша могут развиться серьезные патологии. Чаще всего возникает эритробластоз – явление, при котором организм ребенка не может вырабатывать достаточное количество эритроцитов.
Кроме того, из-за резус-конфликта может произойти гибель плода в утробе или сразу же после рождения. При правильном подходе к лечению таких серьезных последствий удается легко избежать.
Отклонения от нормы
При положительном результате на реакцию Кумбса врач делает вывод о том, что в сыворотке крови имеются антитела к эритроцитам. Это говорит о том, что кровь донора не может быть совместима с кровью пациента.
Если же положительный результат диагностируется в организме беременной с резус-отрицательной кровью, то в ее организме присутствуют антитела к крови плоду.
Это говорит о резус-конфликте, который требует крайне внимательного подхода к ведению беременности со стороны врача, а также выполнение всех указаний и рекомендаций от женщины.
Если же антитела присутствуют в крови ребенка, диагностируется гемолитическая болезнь новорожденных. В таком случае проводится повторное исследование, позволяющее определить, происходит ли нарастание цитра антител в кровь будущей матери или нет.
Возможные осложнения от теста Кумбса
Тест Кумбса – довольно безопасное исследование, позволяющее на начальных стадиях диагностировать ряд аутоиммунных заболеваний. Оно редко вызывает осложнения, обычно негативное последствия связаны с забором крови.
Они заключаются в:
- Кровотечениях ли кровоизлияниях под кожу
- Головокружениях и обмороках
- Инфекционном заражении
7 295
