Hämagglutinationshemmungsreaktion (HRT). Immobilisierungsreaktionen. Immunlysereaktionen. Hämagglutinationshemmungsreaktionstechnik. Immunologische Methoden Anwendung der Hämagglutinationsmethode in der Virologie

RHA basiert auf der Fähigkeit roter Blutkörperchen, zusammenzukleben, wenn bestimmte Antigene an ihnen adsorbiert werden. Als Testmaterial für die Hämagglutination werden Allantois- und Fruchtwasser, eine Suspension von Chorioallantoismembranen von Hühnerembryonen, Suspensionen und Extrakte aus Kulturen oder Organen von mit Viren infizierten Tieren sowie natives infektiöses Material verwendet. RGA ist nicht serologisch, da sie ohne Beteiligung von Immunserum erfolgt und zur Auswahl der Arbeitsverdünnung des Antigens für die Durchführung von RGA oder des Vorhandenseins eines Antigens (Virus) im Testmaterial (z. B. bei Influenza) verwendet wird. Die Reaktion nutzt rote Blutkörperchen von Tieren, Vögeln und Menschen der Blutgruppe I (0).

Um eine ungefähre RGA festzulegen, werden ein Tropfen einer 5 %igen Suspension roter Blutkörperchen und ein Tropfen des Testmaterials auf einen Glasobjektträger aufgetragen und gründlich gemischt. Bei positives Ergebnis Nach 1-2 Minuten wird makroskopisch das Auftreten einer flockigen Agglutination der Erythrozyten beobachtet.

Um RGA in einer ungefalteten Reihe in den Vertiefungen von Polystyrolplatten anzubringen, werden doppelt steigende Verdünnungen des Testmaterials in physiologischer Lösung in einem Volumen von 0,5 ml hergestellt. In alle Reagenzgläser werden 0,5 ml einer 0,25 - 1 %igen Suspension roter Blutkörperchen gegeben. Die Ergebnisse werden nach vollständiger Sedimentation der Erythrozyten in der Kontrolle (rote Blutkörperchen + Kochsalzlösung) berücksichtigt. Die Reaktion wird durch die Beschaffenheit des Erythrozytensediments berücksichtigt. In positiven Fällen wird der Grad der Agglutination mit Pluszeichen gekennzeichnet. Eine Reaktion, die wie ein dünner Film aus klebrigen roten Blutkörperchen aussieht, der den Boden eines Reagenzglases (Regenschirms) bedeckt, wird mit vier Pluspunkten bewertet; eine Reaktion mit Lücken im Film wird mit drei Pluspunkten gekennzeichnet; Ränder klebriger roter Blutkörperchen sind mit zwei Pluspunkten gekennzeichnet; ein flockiges Sediment roter Blutkörperchen, umgeben von einer Zone verklumpter Erythrozyten, entspricht einem Pluspunkt. Ein scharf abgegrenztes Erythrozytensediment, das von der Kontrolle nicht zu unterscheiden ist, weist auf das Fehlen einer Agglutination hin. Als Titer gilt die maximale Verdünnung des Untersuchungsmaterials, die eine Agglutination der Erythrozyten um zwei Pluspunkte verursachte.

Wenn das RGA-Ergebnis positiv ist, wird die Studie fortgesetzt, wobei der Typ des isolierten Virus mithilfe einer Hämagglutinationshemmreaktion mit typspezifischen Seren bestimmt wird.

RTGA basiert auf der Eigenschaft des Antiserums, die virale Hämagglutination zu unterdrücken, da das durch spezifische Antikörper neutralisierte Virus die Fähigkeit verliert, rote Blutkörperchen zu agglutinieren. Zur vorläufigen Typisierung von Viren wird die Tröpfchenmethode auf Glas verwendet. Um den Typ des isolierten Virus endgültig zu bestimmen und die Antikörper in den Seren zu titrieren, wird ein expandiertes RTGA in Reagenzgläser oder Vertiefungen gegeben. Zu diesem Zweck werden zweifache Verdünnungen von Seren in physiologischer Lösung hergestellt und in 0,25 ml abgefüllt. Zu den Serumverdünnungen einen Tropfen virushaltiges Material und einen Tropfen einer 1 %igen Suspension roter Blutkörperchen hinzufügen.

Bei der Verwendung von RTGA zur Bestimmung des Virustyps werden typspezifische Seren verwendet, die einem gleichen Volumen der Arbeitsverdünnung des Antigens zugesetzt werden. Der Typ des isolierten Virus wird durch das spezifische Immunserum bestimmt, das den höchsten Antikörpertiter gegen dieses Virus aufweist.

RGA und RTGA werden häufig für die Diagnose verwendet Virusinfektionen(durch Zecken übertragene Enzephalitis, Influenza usw.), um spezifische Antikörper nachzuweisen und viele Viren anhand ihrer Antigene zu identifizieren.

Viele Viren haben die Fähigkeit, rote Blutkörperchen strikt zu verklumpen bestimmte Typen Säugetiere und Vögel. Somit sind Influenzaviren und Mumps die roten Blutkörperchen von Hühnern verklumpen, Meerschweinchen, Menschen und Adenoviren – Erythrozyten von Ratten und Mäusen. In diesem Zusammenhang, um sie im Material von Patienten oder Kulturen von Zellen, Embryonen und Tieren nachzuweisen, Hämagglutinationsreaktion(RGA). Bereiten Sie dazu doppelt ansteigende Verdünnungen virushaltiger Materialien und Flüssigkeiten in den Vertiefungen der Platten vor und fügen Sie ihnen mit einer isotonischen Lösung gewaschene Suspensionen hinzu NaCl der roten Blutkörperchen. Um die spontane Agglutination zu kontrollieren, werden rote Blutkörperchen mit einem gleichen Volumen isotonischer NaCl-Lösung gemischt. Die Mischungen werden in einem Thermostat bei 37 °C oder bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Ergebnisse der RGA werden durch die Art der Erythrozytenagglutination nach 30–60 Minuten berücksichtigt, wenn sie in der Kontrolle normalerweise vollständig ausgefällt sind. Eine positive Reaktion wird durch Pluspunkte angezeigt. „++++“ – Sediment in Form eines „Regenschirms“, „+++“ – Sediment mit Lumen, „++“ – Sediment mit großen Lumen, „+“ – flockiges Sediment, umgeben von einer Zone zerknitterter Erythrozyten und „–“ – das gleiche scharf abgegrenzte Erythrozytensediment in Form eines „Knopfes“ wie in der Kontrolle

Da RGA gruppenspezifisch ist, ist es nicht möglich, die Art der Viren zu bestimmen. Sie werden mit identifiziert Hämagglutinationshemmungsreaktionen(RTGA). Zur Herstellung werden bekannte immunantivirale Seren verwendet, die in einer isotonischen Natriumchloridlösung in zweifach abnehmender Konzentration verdünnt und in die Vertiefungen gegossen werden. Jeder Verdünnung wird die gleiche Menge virushaltiger Flüssigkeit zugesetzt. Die Kontrolle ist eine Suspension des Virus in einer isotonischen Natriumchloridlösung. Die Platten mit einer Mischung aus Seren und Viren werden 30 Minuten lang in einem Thermostat oder 2 Stunden lang bei Raumtemperatur aufbewahrt, dann wird jeder von ihnen eine Suspension roter Blutkörperchen zugesetzt. Nach 30 Minuten wird der Titer des virusneutralisierenden Serums (d. h. seine maximale Verdünnung) bestimmt, der eine Verzögerung der Erythrozytenagglutination verursachte.

RTGA wird in der serologischen Diagnostik viraler Erkrankungen, insbesondere Influenza, eingesetzt adenovirale Infektionen. Es ist besser, es wie RN mit gepaarten Seren zu verwenden. Ein vierfacher Anstieg des Antikörpertiters im zweiten Serum bestätigt die Verdachtsdiagnose

Neutralisierungsreaktion.

Identifizieren Sie das Virus anhand der Art seiner Wirkung auf eine Zellkultur-Monoschicht, die es zerstört oder verschiedene Arten von Zellkulturen verursacht strukturelle Veränderungen, ist sehr schwierig, und deshalb greifen sie auf die Inszenierung zurück Neutralisationsreaktionen(RN) von Viren mit bekannten virusneutralisierenden Seren. Dazu wird das vom Patienten gewonnene Virus in Zellkultur angereichert und in seinen verschiedenen Verdünnungen mit unverdünntem antiviralem Serum vermischt oder umgekehrt eine konstante Dosis des Virus zu verschiedenen Verdünnungen des Immunserums gegeben. Die Mischungen werden in einem Thermostat inkubiert. Anschließend wird eine Zellkultur mit einer Mischung aus Virus und Serum infiziert und die neutralisierende Wirkung ihrer Antikörper anhand der Abwesenheit einer zytopathischen Wirkung auf die Zellen beurteilt. Eine Mischung aus Viren und Seren kann Hühnerembryonen oder empfindliche Tiere infizieren. In solchen Fällen wird die neutralisierende Aktivität von Antikörpern durch die Verhinderung der Entwicklung bestimmt pathologische Veränderungen auf der Chorioallantoismembran; Neutralisierung viraler Hämagglutinine in Embryonalflüssigkeiten, wodurch die tödliche Wirkung des Virus auf Tiere beseitigt wird

In ähnlicher Weise werden mit Hilfe von RN Viren identifiziert, die bei der Infektion von Hühnerembryonen und Tieren aus dem Material von Patienten isoliert wurden. In solchen Fällen werden den virusneutralisierenden Seren virushaltige Embryonalflüssigkeiten und Suspensionen befallener Tierorgane zugesetzt. Nach einer gewissen Inkubationszeit werden Zellkulturen, Hühnerembryonen und Tiere mit den Mischungen infiziert.

Bei der Serodiagnose viraler Infektionen RN werden virusneutralisierende Antikörper im Serum von Patienten anhand eines bekannten Virus bestimmt. Sie setzen es mit gepaarten Seren in Dynamik, von denen eines auf dem Höhepunkt der Krankheit und das zweite nach 2-3 Wochen entnommen wird, und die Diagnose wird durch einen vierfachen Anstieg des Antikörpertiters bei letzterem bestätigt.

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69. Chemotherapeutika. Das Konzept des chemotherapeutischen Index. Die Hauptgruppen chemotherapeutischer Arzneimittel, der Mechanismus ihrer antibakteriellen Wirkung.
71. Arzneimittelresistenz von Mikroorganismen und der Mechanismus ihres Auftretens. Das Konzept der Krankenhausstämme von Mikroorganismen. Möglichkeiten zur Überwindung von Arzneimittelresistenzen.
72. Methoden zur mikrobiologischen Diagnose von Infektionskrankheiten.
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81. Gonokokken. Taxonomie. Merkmal. Mikrobiologische Diagnose von Gonorrhoe. Behandlung.
82. Erreger der Tularämie. Taxonomie. Eigenschaften. Mikrobiologische Diagnostik. Spezifische Prävention und Behandlung.
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84. Erreger der Brucellose. Taxonomie und Merkmale. Mikrobiologische Diagnostik. Spezifische Prävention und Behandlung.
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86. Erreger einer anaeroben Gasinfektion. Taxonomie und Merkmale. Mikrobiologische Diagnostik. Spezifische Prävention und Behandlung.
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89. Nicht sporenbildende Anaerobier. Taxonomie. Eigenschaften. Mikrobiologische Diagnose und Behandlung.
90. Der Erreger der Diphtherie. Taxonomie und Merkmale. Bedingt pathogene Corynebakterien. Mikrobiologische Diagnostik. Nachweis einer anoxischen Immunität. Spezifische Prävention und Behandlung.
91. Erreger von Keuchhusten und Parakeuchhusten. Taxonomie und Merkmale. Mikrobiologische Diagnostik. Spezifische Prävention und Behandlung.
92. Erreger der Tuberkulose. Taxonomie und Merkmale. Bedingt pathogene Mykobakterien. Mikrobiologische Diagnose von Tuberkulose.
93. Actinomyceten. Taxonomie. Merkmal. Mikrobiologische Diagnostik. Behandlung.
95. Der Erreger von Chlamydien. Taxonomie. Eigenschaften. Mikrobiologische Diagnostik. Behandlung.
96. Erreger der Syphilis. Taxonomie. Merkmal. Mikrobiologische Diagnostik. Behandlung.
97. Erreger der Leptospirose. Taxonomie. Eigenschaften. Mikrobiologische Diagnostik. Spezifische Prävention. Behandlung.
98. Erreger der Borreliose. Taxonomie. Eigenschaften. Mikrobiologische Diagnostik.
99. Klinische Mikrobiologie, ihre Aufgaben. Vbi, Merkmale der Entstehungsursache. Die Rolle opportunistischer Mikroorganismen beim Auftreten nosokomialer Infektionen.
100. Klassifizierung von Pilzen. Merkmal. Rolle in der Pathologie. Labordiagnostik. Behandlung.
101. Klassifizierung von Mykosen. Oberflächliche und tiefe Mykosen. Hefeähnliche Pilze der Gattung Candida. Rolle in der menschlichen Pathologie.
102. Der Erreger der Grippe. Taxonomie. Merkmal. Labordiagnostik. Spezifische Prävention und Behandlung.
103. Der Erreger der Kinderlähmung. Taxonomie und Merkmale. Labordiagnostik. Spezifische Prävention.
104. Erreger der Hepatitis a und e. Taxonomie. Eigenschaften. Labordiagnostik. Spezifische Prävention.
105. Erreger der durch Zecken übertragenen Enzephalitis. Taxonomie. Eigenschaften. Labordiagnostik. Spezifische Prävention.
106. Tollwut-Agent. Taxonomie. Eigenschaften. Labordiagnostik. Spezifische Prävention.
RTGA wird verwendet zur Diagnose vieler Viruserkrankungen, deren Erreger (Influenzaviren, Masern, Röteln, Frühsommer-Meningoenzephalitis etc.) die Erythrozyten verschiedener Tiere verklumpen können.
Mechanismus. Die Virustypisierung erfolgt in der Häma(HRI) mit einem Satz typspezifischer Seren. Die Ergebnisse der Reaktion werden durch das Fehlen einer Hämagglutination berücksichtigt. Subtypen des Virus A mit den Antigenen H 0 N 1, H 1 N 1, H 2 N 2, H 3 N 2 usw. können in RTGA mit einem Satz homologer typspezifischer Seren differenziert werden.
52. Niederschlagsreaktion. Mechanismus. Komponenten. Staging-Methoden. Anwendung .
Fällungsreaktion (RP)- Dies ist die Bildung und Ausfällung eines Komplexes aus löslichem molekularem Antigen mit Antikörpern in Form einer Trübung, die als Präzipitat bezeichnet wird. Es entsteht durch Mischen von Antigenen und Antikörpern in äquivalenten Mengen; Ein Überschuss an einem von ihnen verringert die Bildung von Immunkomplexen.
RP ist eingestellt in Reagenzgläsern (Ringfällungsreaktion), in Gelen, Nährmedien etc. Weit verbreitet sind Sorten von RP in halbflüssigem Agar oder Agarosegel: doppelte Immundiffusion nach Ouchterlony, radiale Immundiffusion, Immunelektrophorese etc.
Mechanismus. Es wird mit transparenten kolloidalen löslichen Antigenen durchgeführt, die aus pathologischem Material, Umweltobjekten oder reinen Bakterienkulturen extrahiert werden. Die Reaktion verwendet klare diagnostische Fällungsseren mit hohen Antikörpertitern. Als Titer des ausfallenden Serums wird die höchste Verdünnung des Antigens angenommen, die bei Wechselwirkung mit dem Immunserum zur Bildung eines sichtbaren Niederschlags – einer Trübung – führt.
Ringfällungsreaktion in schmale Reagenzgläser (Durchmesser 0,5 cm) gegeben, in die 0,2-0,3 ml ausfallendes Serum gegeben werden. Dann werden mit einer Pasteurpipette 0,1–0,2 ml Antigenlösung langsam geschichtet. Die Röhrchen werden vorsichtig in eine vertikale Position gebracht. Bei einer positiven Reaktion erscheint ein Niederschlag in Form eines weißen Rings an der Grenze zwischen Serum und Testantigen In den Kontrollröhrchen bildet sich kein Niederschlag.
53. Komplementfixierungsreaktion. Mechanismus. Komponenten. Anwendung.
Komplementfixierungsreaktion(RSK) liegt darin, dass Antigene und Antikörper, wenn sie einander entsprechen, einen Immunkomplex bilden, an den das Komplement (C) über das Fc-Fragment der Antikörper gebunden ist, d. h. das Komplement wird durch den Antigen-Antikörper-Komplex gebunden. Wird der Antigen-Antikörper-Komplex nicht gebildet, bleibt das Komplement frei.
Die spezifische Wechselwirkung von AG und AT geht mit der Adsorption (Bindung) von Komplement einher. Da sich der Prozess der Komplementfixierung nicht visuell manifestiert, schlugen J. Bordet und O. Zhang vor, das hämolytische System (rote Blutkörperchen vom Schaf + hämolytisches Serum) als Indikator zu verwenden, der anzeigt, ob Komplement durch den AG-AT-Komplex fixiert wird. Wenn AG und AT einander entsprechen, sich also ein Immunkomplex gebildet hat, wird das Komplement durch diesen Komplex gebunden und es kommt nicht zu einer Hämolyse. Wenn AT nicht AG entspricht, wird der Komplex nicht gebildet und das Komplement, das frei bleibt, verbindet sich mit dem zweiten System und verursacht eine Hämolyse.
Komponenten. Die Komplementfixierungsreaktion (CFR) ist eine komplexe serologische Reaktion. Zur Durchführung werden 5 Zutaten benötigt, nämlich: AG, AT und Komplement (erstes System), Schaf-Erythrozyten und hämolytisches Serum (zweites System).
Antigen Für RSC können Kulturen verschiedener abgetöteter Mikroorganismen, deren Lysate, Bestandteile von Bakterien, pathologisch veränderte und normale Organe, Gewebelipide, Viren und virushaltige Materialien vorliegen.
Als ergänzen Verwenden Sie frisches oder getrocknetes Meerschweinchenserum.
Mechanismus. RSK wird in zwei Phasen durchgeführt: 1. Phase – Inkubation einer Mischung, die drei Komponenten Antigen + Antikörper + Komplement enthält; 2. Phase (Indikator) – Nachweis von freiem Komplement in der Mischung durch Zugabe eines hämolytischen Systems bestehend aus Schaferythrozyten und hämolytischem Serum, das Antikörper dagegen enthält. In der 1. Phase der Reaktion, wenn der Antigen-Antikörper-Komplex gebildet wird, bindet das Komplement, und in der 2. Phase kommt es dann nicht zu einer Hämolyse der durch Antikörper sensibilisierten Erythrozyten; Die Reaktion ist positiv. Wenn Antigen und Antikörper nicht zueinander passen (es gibt kein Antigen oder Antikörper in der Testprobe), bleibt das Komplement frei und verbindet sich in der 2. Phase mit dem Erythrozyten-Anti-Erythrozyten-Antikörper-Komplex, was zu einer Hämolyse führt; Die Reaktion ist negativ.
Anwendung. RSC wird zur Diagnose vieler Infektionskrankheiten, insbesondere der Syphilis (Wassermann-Reaktion), eingesetzt.

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1. Hämagglutinationsreaktion

(RGA)

eine Methode zum Nachweis und zur Identifizierung von Viren, die auf der Fähigkeit einiger Viren basiert, die roten Blutkörperchen bestimmter Tierarten selektiv zu agglutinieren.

RGA basiert auf dem Phänomen der Adhäsion roter Blutkörperchen, das unter dem Einfluss verschiedener Faktoren auftritt. Es gibt direkte und indirekte Hämagglutination. Bei der direkten Hämagglutinationsreaktion verkleben rote Blutkörperchen, wenn bestimmte Antigene, beispielsweise Viren, an ihnen adsorbieren.

In serologischen Studien wird eine direkte Hämagglutinationshemmungsreaktion eingesetzt, bei der das aus einem Patienten isolierte Virus mit spezifischem Immunserum neutralisiert und dann mit roten Blutkörperchen kombiniert wird. Das Fehlen einer Hämagglutination weist auf die Konsistenz des Virus und des verwendeten Immunserums hin.

Die indirekte Hämagglutinationsreaktion (passive Hämagglutination) wird beobachtet, wenn Immunserum oder Patientenserum, das entsprechende Antikörper enthält, roten Blutkörperchen zugesetzt wird, die zuvor mit verschiedenen Antigenen behandelt (sensibilisiert) wurden. Es kommt zu einer spezifischen Verklebung der roten Blutkörperchen, ihrer passiven Hämagglutination.

Die indirekte oder passive Hämagglutinationsreaktion ist anderen serologischen Methoden in Sensitivität und Spezifität überlegen und wird zur Diagnose von Infektionen durch Bakterien, Rickettsien und Protozoen eingesetzt.

Die Methode zur Durchführung einer indirekten Hämagglutinationsreaktion besteht aus mehreren Schritten. Zunächst werden rote Blutkörperchen mit einer isotonischen Natriumchloridlösung gewaschen, dann bei Bedarf (bei Verwendung von Proteinantigenen) mit einer Tanninlösung 1:20.000 behandelt und mit löslichen Antigenen sensibilisiert. Nach dem Waschen mit einer gepufferten isotonischen Natriumchloridlösung ist das Erythrozytenantigen gebrauchsfertig. Die Testseren werden mit einer isotonischen Natriumchloridlösung in Reagenzgläsern oder speziellen Kunststoffplatten mit Vertiefungen verdünnt, anschließend wird jeder Verdünnung des Serums ein Erythrozytendiagnostikum zugesetzt. Die Ergebnisse der indirekten Hämagglutinationsreaktion werden durch die Art des Sediments der roten Blutkörperchen berücksichtigt, das sich am Boden des Reagenzglases bildet. Ein Reaktionsergebnis, bei dem rote Blutkörperchen gleichmäßig den gesamten Boden des Röhrchens bedecken, gilt als positiv. Bei negative Reaktion Rote Blutkörperchen in Form einer kleinen Scheibe oder eines „Knopfes“ befinden sich in der Mitte des Bodens des Reagenzglases.

Verwendung von RGA

RGA dient zur Indikation (Nachweis) von Viren in der Vordiagnostik, zur Titrierung von Viren nach hämagglutinierenden Eigenschaften (Aufbau hämagglutinierender Einheiten – AE).

Virusadsorption

Grundlage des durch Viren verursachten Agglutinationsphänomens ist die Adsorption von Viren an der Oberfläche roter Blutkörperchen, begleitet von deren Verklebung (Agglutination) und Ausfällung.

Antigen für RGA

Als Antigen für RGA wird jedes Material (pathologisches Material in Form einer Organsuspension, Material aus infizierten ECs, Gewebekulturen usw.) verwendet, bei dem der Verdacht auf das Vorhandensein eines Virus besteht. Das Material muss flüssig sein, ohne große Partikel.

Einrichten einer ungefähren RGA

Um eine ungefähre RGA festzulegen, wird ein Tropfen virushaltiges Material auf einen sauberen und gut entfetteten Glasobjektträger aufgetragen, ein Tropfen einer 5%igen Suspension roter Blutkörperchen hinzugefügt und mit einem Glasstab vermischt.

Auswertung der Reaktion der RGA

Die Reaktion wird in Kreuzen (Pluspunkten) bewertet. Achten Sie bei der Beurteilung der Reaktion bei Kreuzen auf die Beschaffenheit des Sediments. Wenn sich die roten Blutkörperchen in einer dünnen Schicht gleichmäßig am Boden des Reagenzglases (in Form eines Regenschirms) ablagern, wird die Reaktion als vier Kreuze gewertet

2. Hämagglutinationshemmungsreaktion- eine serologische Reaktion, die auf der Fähigkeit von Antikörpern basiert, die Agglutination von Erythrozyten durch hämagglutinierende Virustypen (Adenoviren, Arboviren, einige Enteroviren, Influenza- und Parainfluenzaviren, Masern, Reoviren) zu verhindern. Spezifische antivirale Antikörper interagieren mit den Oberflächenhämagglutininmolekülen der Virionen dieser Viren und blockieren deren Bindung an komplementäre Moleküle der Erythrozytenmembran.

In jüngster Zeit wird die Reaktion in klinischen Virologielabors häufig zur Bestimmung der Titer spezifischer Antikörper gegen bestimmte Viren sowie zur serologischen Identifizierung und Typisierung von Virusisolaten aus klinischem Material von Patienten eingesetzt. Ihre Verwendung ist etwas eingeschränkt, da im menschlichen Blutserum unspezifische Virusinhibitoren sowie natürliche Antikörper - Agglutinine - vorhanden sind.

Hämagglutinationshemmungsreaktion (HAI). Trotz des Namens ähnelt das Reaktionsprinzip in vielerlei Hinsicht dem pH-Wert von Viren, da es auf der Fähigkeit von AT basiert, verschiedene Viren zu binden und zu neutralisieren, wodurch eine Agglutination roter Blutkörperchen unmöglich wird. Optisch äußert sich dieser Effekt in der „Hemmung“ der Hämagglutination. RTGA wird bei der Diagnose von Virusinfektionen verwendet, um spezifische Antihämagglutinine zu identifizieren und verschiedene Viren anhand ihrer Hämagglutinine zu identifizieren, die die Eigenschaften von Ag aufweisen.

Hämagglutinationshemmungsreaktion

(RTGA)

Eine Methode zur Identifizierung eines Virus oder zum Nachweis antiviraler Antikörper im Blutserum eines Patienten, die auf dem Phänomen der fehlenden Agglutination roter Blutkörperchen durch ein einen Virus enthaltendes Arzneimittel in Gegenwart eines dagegen immunisierten Blutserums basiert.

Hämagglutinationshemmungsreaktion. Mechanismus und praktischer Nutzen.

Viele Viren haben die Fähigkeit, rote Blutkörperchen genau definierter Säugetier- und Vogelarten zu verklumpen. So verklumpen Influenza- und Mumpsviren die Erythrozyten von Hühnern, Meerschweinchen und Menschen, Adenoviren die Erythrozyten von Ratten und Mäusen. In diesem Zusammenhang, um sie im Material von Patienten oder Kulturen von Zellen, Embryonen und Tieren nachzuweisen, Hämagglutinationsreaktion(RGA). Zu diesem Zweck werden in den Vertiefungen der Platten doppelt ansteigende Verdünnungen virushaltiger Materialien und Flüssigkeiten hergestellt und mit einer isotonischen Lösung gewaschenen Erythrozytensuspensionen NaCl zugesetzt. Um die spontane Agglutination zu kontrollieren, werden rote Blutkörperchen mit einem gleichen Volumen isotonischer NaCl-Lösung gemischt. Die Mischungen werden in einem Thermostat bei 37 °C oder bei Raumtemperatur inkubiert.

RTGA wird in der serologischen Diagnostik von Viruserkrankungen, insbesondere Influenza und adenoviralen Infektionen, eingesetzt. Es ist besser, es wie RN mit gepaarten Seren zu verwenden. Ein vierfacher Anstieg des Antikörpertiters im zweiten Serum bestätigt die Verdachtsdiagnose

3. Serologische Studie ermöglicht die Diagnose, wenn im Serum von Patienten spezifische Antikörper nachgewiesen werden. Für serologische Reaktionen werden gepaarte Seren verwendet, die in den ersten Tagen nach Ausbruch der Erkrankung und nach 1 - 3 Wochen entnommen, aber gleichzeitig untersucht werden. Ein Anstieg des Antikörpertiters um das Vierfache oder mehr ist von diagnostischer Bedeutung. RTGA, RN, RSK, RTGads, RIF, RIA, ELISA werden mit Antigenen (Diagnostika) verwendet, die aus Referenzstämmen der entsprechenden Viren hergestellt wurden.

4. Gepaart – das bedeutet, dass in einem bestimmten Zeitabstand zweimal Blut entnommen wird. Durch die Erhöhung des Antikörpertiters wird festgestellt, dass eine Infektion vorliegt. Wenn sich der Antikörpertiter nicht ändert, bedeutet das, dass diese Antikörper schon lange im Körper sind und keine frische Infektion vorliegt.

Den größten diagnostischen Wert hat die Untersuchung gepaarter Seren von Tieren zu Beginn und am Ende der Krankheit (im Abstand von 14 bis 21 Tagen). Das Serum wird in sterilen Röhrchen gesammelt und zum Testen aufbewahrt.

Beschreibung

Das Diagnosekit für Schweine-Parvovirus-Erkrankungen dient zum Nachweis von Parvovirus-Antigenen in Suspension innere Organe abgetriebene Föten bei der Hämagglutinationsreaktion (HRA) und spezifische Antikörper im Blutserum von Schweinen sowie neugeborenen Ferkeln (vor der Kolostrumgabe) bei der Hämagglutinationshemmungsreaktion (HIA).

Die Reaktion wird nach der Mikromethode in den Vertiefungen von Polystyrolplatten durchgeführt.

96-Well-Platten aus Polystyrol für immunologische Reaktionen;

spezifisches inaktiviertes Antigen mit einer hämagglutinierenden Aktivität von mindestens 1:128;

spezifisches Serum mit einer Aktivität in RTGA von nicht weniger als 1:256;

Serum normal (Negativkontrolle).

Analysezeit:

RGA – 2,5–3,5 Stunden, RTGA – 3,5–4,5 Stunden (ohne Berücksichtigung der Zeit für die Vorbereitung der Materialien für die Studie).

Prinzip der Methode:

Die Hämagglutinationsreaktion (HRA) basiert auf der Verklebung von in Flüssigkeit suspendierten roten Blutkörperchen unter dem Einfluss der hämagglutinierenden Eigenschaften des Virus und der Bildung eines lockeren Sediments in Form eines Regenschirms. Die Essenz von RTHA besteht darin, die hämagglutinierenden Eigenschaften des Virus mit spezifischen Antikörpern im Blutserum zu neutralisieren, wodurch rote Blutkörperchen nicht zusammenkleben und sich am Boden absetzen und ein dichtes Sediment in Form von a bilden Taste.

Lagerbedingungen

Das Kit wird an einem trockenen, lichtgeschützten Ort bei einer Temperatur von 2 bis 8 °C gelagert.

Nach dem Auflösen können die Kit-Komponenten einen Monat lang gefroren gelagert werden; ein erneutes Einfrieren ist nicht zulässig.

Haltbar bis

Rote Blutkörperchen (oder Latexpartikel) mit darauf adsorbierten Antigenen interagieren mit den entsprechenden Antikörpern im Blutserum, was dazu führt, dass die roten Blutkörperchen zusammenkleben und in Form einer Welle auf den Boden des Reagenzglases oder der Zelle fallen Sediment.

Bei einer negativen Reaktion setzen sich rote Blutkörperchen knopfförmig ab. Agglutinationsreaktion

Die Ergebnisse der Reaktion werden mikroskopisch und visuell berücksichtigt und nach folgendem Schema kreuzweise ermittelt:

(++++) – vollständige Klärung der Flüssigkeit und Bildung eines Agglutinats am Boden der Vertiefung in Form eines umgekehrten „Regenschirms“, der beim Schütteln in Flocken zerfällt;

(+++) - unvollständige Reinigung der Flüssigkeit und ein klar definierter „Regenschirm“;

(++) - spürbare Klärung der Flüssigkeit, der „Regenschirm“ ist mäßig ausgeprägt;

(+) - kaum wahrnehmbare Klärung der Flüssigkeit, der „Regenschirm“ ist schwach ausgeprägt;

(-) - negatives Ergebnis, die Flüssigkeit hat sich nicht geklärt, am Boden der Vertiefung befindet sich ein knopfförmiges Sediment, bei leichtem Schütteln entsteht eine gleichmäßige Suspension.

Als Antikörpertiter wurde die letzte Verdünnung des Testserums herangezogen, bei der eine Agglutination von mindestens zwei Kreuzen auftrat (++).

№ 83 Enzymimmunoassay, Immunblotting. Mechanismus, Komponenten, Anwendung.
Enzymimmunoassay oder Methode – Nachweis von Antigenen unter Verwendung entsprechender Antikörper, die an ein Tag-Enzym (Meerrettich-Peroxidase, Beta-Galactosidase oder alkalische Phosphatase) konjugiert sind. Nach der Kombination des Antigens mit dem enzymmarkierten Immunserum wird der Mischung das Substrat/Chromogen zugesetzt. Das Substrat wird durch das Enzym gespalten und die Farbe des Reaktionsprodukts ändert sich – die Intensität der Farbe ist direkt proportional zur Anzahl der gebundenen Antigen- und Antikörpermoleküle. ELISA wird verwendet zur Diagnose viraler, bakterieller und parasitärer Erkrankungen, insbesondere zur Diagnose von HIV-Infektionen, Hepatitis B etc., sowie zur Bestimmung von Hormonen, Enzymen, Medikamenten und anderen biologisch aktiven Substanzen, die im Untersuchungsmaterial in geringen Konzentrationen enthalten sind (10 10 -10 12 g/l).

Festphasen-ELISA- eine Testvariante, bei der eine der Komponenten der Immunreaktion (Antigen oder Antikörper) auf einem festen Träger, beispielsweise in den Vertiefungen von Polystyrolplatten, sorbiert wird. Der Nachweis der Komponenten erfolgt durch Zugabe markierter Antikörper oder Antigene. Bei einem positiven Ergebnis verändert sich die Farbe des Chromogens. Nach jeder Zugabe einer weiteren Komponente werden ungebundene Reagenzien durch Waschen aus den Vertiefungen entfernt.

I. Bei der Bestimmung von Antikörpern (linke Abbildung) werden das Blutserum des Patienten, das mit einem Enzym markierte Antiglobulinserum und ein Substrat/Chromogen für das Enzym nacheinander in die Vertiefungen von Platten mit sorbiertem Antigen gegeben.

II. Bei der Bestimmung eines Antigens (rechte Abbildung) wird ein Antigen mit sorbierten Antikörpern (z. B. Blutserum mit dem gewünschten Antigen), einem diagnostischen Serum dagegen und sekundären Antikörpern (gegen das diagnostische Serum) mit einem Enzym markiert in die Vertiefungen gegeben , werden hinzugefügt, und dann ein Substrat/Chromogen für das Enzym.

Kompetitiver ELISA zur Identifizierung von Antigenen: Das Zielantigen und das enzymmarkierte Antigen konkurrieren miteinander um die Bindung einer begrenzten Menge an Immunserumantikörpern.

Ein weiterer Test ist der kompetitive ELISA zur Bestimmung von Antikörpern: Die gewünschten Antikörper und enzymmarkierten Antikörper konkurrieren miteinander um an der Festphase adsorbierte Antigene.

Immunblotting- eine hochempfindliche Methode zum Nachweis von Proteinen, basierend auf einer Kombination aus Elektrophorese und ELISA oder RIA. Immunblotting wird als diagnostische Methode für HIV-Infektionen usw. verwendet.

Krankheitserregerantigene werden mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt, dann vom Gel auf aktiviertes Papier oder eine Nitrozellulosemembran übertragen und mittels ELISA entwickelt. Unternehmen stellen solche Streifen mit „Blots“ von Antigenen her. Auf diese Streifen wird das Serum des Patienten aufgetragen. . Anschließend wird der Patient nach der Inkubation von ungebundenen Antikörpern befreit und mit einem Enzym markiertes Serum gegen menschliche Immunglobuline aufgetragen . Der auf dem Streifen gebildete Komplex [Antigen + Patientenantikörper + Antikörper gegen menschliches Ig] wird durch Zugabe eines chromogenen Substrats nachgewiesen, das unter Einwirkung eines Enzyms seine Farbe ändert.

53. Komplementfixierungsreaktion. Mechanismus. Komponenten. Anwendung.

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